G-eiwitgekoppelde receptor: van celsignalering tot geneesmiddelenontdekking

G-eiwitgekoppelde receptoren, of kortweg GPCR's, zijn membraaneiwitten die cellen helpen reageren op signalen van buiten de cellen. Deze signalen kunnen hormonen, neurotransmitters, lipiden, peptiden en licht omvatten.

Hoewel er een duidelijke overeenkomst van structuur is in de zeven-transmembrane structuur van de GPCR's, functioneren ze niet op dezelfde manier. De resultaten van een experiment kunnen afhangen van de ligand voor de receptor, de celomgeving, het expressieniveau van de receptor en de signaalpartners.

Onderzoekers moeten dan verder gaan dan deze meting van de "activatie" van een receptor door een verbinding om GPCR-biologie te ontcijferen. Alle paden, timing, assayformaat, controles en celmodel zijn belangrijk.

G Eiwitgekoppelde Receptor: Wat is het?

Het aantal keren dat een typische GPCR het celmembraan doorkruist is 7. De extracellulaire delen binden aan signaalmoleculen en de intracellulaire delen binden aan de G-eiwitten, arrestines, kinasen en andere signaalmoleculen.

GPCR's worden door de IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology ingedeeld in een aantal hoofdklassen, zoals Klasse A, Klasse B, Klasse C, Frizzled en Adhesionreceptoren. Klasse A is de grootste en bevat bekende doelwitten, zoals de adrenerge, de dopamine, de opioïde en de muscarinereceptoren.

Hoewel de structuur vergelijkbaar is, kunnen GPCR's een zeer diverse reeks signalen herkennen. Dit stelt hen in staat om zintuiglijke waarneming, cardiovasculaire regulatie, metabolisme, immuunfuncties, stemming, beweging en nog veel meer te doen.

Hoe worden GPCR's geactiveerd?

Een ligand bindt aan de receptor en zorgt ervoor dat de receptor van vorm verandert. Als gevolg van deze conformationele verandering kan de receptor interageren met een intracellulair signaalproteïne.

Veel GPCR's hebben een heterotrimerisch G-eiwit als eerste partner, bestaande uit alfa-, bèta- en gamma-subunits. Activatie van de receptoren resulteert in de uitwisseling van GDP voor GTP in de alfasubeenheid. De geactiveerde componenten beïnvloeden vervolgens de downstream enzymen, ionenkanalen en tweede boodschappers.

De populairste families van G-eiwitten zijn:

• Gs, dat veroorzaakt meestal een toename van cyclische AMP
• De veelgebruikte naam voor het cyclische AMP-reducerende enzym is gi/o.
• De Gq/11-route die fosfolipase-C- en calciumroutes signaleert
• Het Rho-familie-eiwit en de cytoskeletale responsen kunnen worden gecontroleerd door G12/13.

Deze beschrijving uit het leerboek is nuttig, maar een lijn is een zeldzame vorm van signalering! Een enkele receptor kan via meerdere G-eiwitten signaleren en de optimale signaaltransductie kan variëren afhankelijk van ligand en celtype. GPCRdb vermeldt dat receptoren kunnen interageren met G-eiwitten, GPCR-kinasen en arrestines, wat leidt tot de vorming van diverse intracellulaire signaalroutes.

De rollen van arrestanten

Zodra het G-eiwit is geactiveerd, stopt de signalering door GPCR's niet.

GPCR-kinasen kunnen geactiveerde receptoren fosforyleren. Arrestines kunnen vervolgens met de receptor interageren, verdere koppeling van de receptor aan G-eiwitten remmen, de internalisatie van receptoren bevorderen en betrokken zijn bij andere signaltransductieroutes.

Daarom kan de werving van arrestaties niet worden beschouwd als een "uit-schakelaar." Afhankelijk van de receptor en het experiment kan het de transport, desensitisatie, recycling, degradatie van de receptor beïnvloeden of andere downstreameffecten moduleren.

Omdat zowel G-eiwitsignalering als arrestine-rekrutering belangrijke maatstaven zijn voor de volledige farmacologie van een verbinding, worden ze vaak samen gemeten.

Artikelen in deze sectie onderzoeken de manieren waarop dezelfde receptor tot verschillende reacties kan leiden

De GPCR's zijn niet zomaar aan/uit-schakelaars.

Verschillende liganden kunnen worden gevonden die binden aan verschillende conformationele fasen van de receptor. Het ene type ligand kan hoge activatieniveaus veroorzaken op de ene G-eiwitroute, terwijl de andere route meer arrestine-rekrutering of een ander signaalprofiel kan veroorzaken. Dit wordt doorgaans functionele selectiviteit/biased signaling genoemd.

Achtergronden van de cellen zijn ook belangrijk. Dezelfde receptor kan in twee verschillende laboratoria worden gevonden, maar bevat verschillende hoeveelheden G-eiwitten, arrestines, kinases, enzymen of endogene receptoren in de cellen.

Een ander probleem kan het niveau van de expressie van receptoren zijn. Overmatige expressie kan de reacties op lage activiteitsniveaus versterken en/of de koppelingsvoorkeuren veranderen, en kan er ook toe leiden dat een partiële agonist sterkere activiteit in de cel heeft dan in het natuurlijke weefsel.

Een resultaat moet daarom worden gezien als een indicatie van het gedrag van een volledig experimenteel systeem en niet uitsluitend van de receptor.

Selecteer Assay op basis van biologische vraag

Geen enkele GPCR-test kan alle vragen beantwoorden.

cAMP Assays

Receptoren met Gs- of GI-eiwitten worden doorgaans gemeten met cAMP. Een Gs-respons kan leiden tot een toename van cAMP en een GI-respons kan worden aangegeven door het remmen van gestimuleerde cAMP-productie.

Deze assays worden vaak gebruikt in concentratie-responsstudies, bij karakteriseringsstudies van agonisten en in antagonistenstudies. In antagonistexperimenten wordt meestal een concentratie van de agonist aangebracht na blootstelling van de testverbinding aan de cellen.

Calciumassays

Gq-gekoppelde receptoren kunnen worden bestudeerd door intracellulaire calciumassays. Ze kunnen een snelle en hoge doorvoermeting geven, maar de respons kan kort zijn en sterk afhankelijk zijn van de behandeling van de cellen, de lading van de kleurstoffen, de expressie van de receptor en het tijdstip van de meting.

GTPγS-binding

GTPγS-assays zijn een van de vroegste gebeurtenissen die worden gemeten tijdens het proces van G-eiwitactivatie en worden vaak gebruikt om de activiteit van de agonist in membraanpreparaten te bevestigen. Omdat de assay vrij dicht bij de receptor–G-eiwitinteractie ligt, kan het een deel van de amplificatie die bij downstream metingen wordt ervaren, verminderen.

Arrestin Werving

Arrestine-assays kunnen worden gebruikt om pathwaybias, ligand-specifieke signalen, receptortransport en receptordesensitisatie te onderzoeken. Ze worden het beste gebruikt in combinatie met een G-eiwittest en niet als algemene indicator van de activatie van een receptor.

Levende-cel biosensoren

BRET- en FRET-technieken (en andere biosensormethoden) kunnen signaalgebeurtenissen in levende cellen volgen als functie van de tijd. Het grootste verkooppunt is de kinetische informatie: onderzoekers kunnen meten wanneer signalering begint, wanneer het piekt en dan daalt, omdat ze meer dan één eindpunt meten.

Maak een nauwkeurig GPCR-experiment

Een goede test is gebaseerd op het biologische product en niet op het instrument.

Zorg er allereerst voor dat de receptor tot expressie komt en zich op de juiste plek in het celmembraan bevindt. De lage respons kan niet het gevolg zijn van de lage activiteit van de ligand, maar van slechte receptorexpressie/-trafficking.

Ten tweede, voeg passende bedieningsapparaten toe. Vaak zijn een bekende agonist, een bekende antagonist, voertuigcontroles, niet-transfecteerde cellen en een receptoronafhankelijke controle nodig voor de downstream assay.

Voer tenslotte een volledige concentratie-responscurve uit. Een evaluatie van slechts één concentratie van een verbinding zal geen betrouwbare maatstaf zijn voor potentie, effectiviteit, gedeeltelijke agonisme, toxiciteit of niet-specifieke interferentie met een assay.

Standaardisatie van de timing is ook nodig. Zodra je binnen een paar seconden een calciumsignaal ontvangt en een paar uur later genexpressie meet, kun je de twee niet zomaar vergelijken. Tests die dezelfde receptor meten, kunnen worden gebruikt om verschillende fasen van de respons te meten.

Tot slot, valideer significante resultaten met een orthogonale benadering. Als een verbinding actief wordt gevonden in een cAMP-assay, is het het beste dit te bevestigen met een andere nuttige assay, bindingsassay of met een receptorspecifieke positieve controle. De Assay Guidance Manual suggereert dat zorgvuldige validatie, kwaliteitscontrole en farmacologische karakterisering van GPCR-resultaten zullen worden aanbevolen bij het toewerken van leadoptimalisatie.

GPCR's voor geneesmiddelenontdekking

GPCR's blijven een sleutelrol spelen in geneesmiddelenontdekking, omdat ze betrokken zijn bij veel aspecten van de fysiologie en oppervlakkig op de cel worden uitgedrukt. GPCRdb schat dat 25% van de menselijke hormonen betrokken is bij de respons op leden van deze receptorfamilie, en dat ongeveer een derde van alle geneesmiddelen zich richt op leden van deze receptorfamilie.

Voor traditionele programma's waren de belangrijkste zoekdoelen agonisten of antagonisten die binden aan de hoofdligandbindingssite. Onderzoek naar allosterische modulatoren, route-biased liganden, receptor-transducer-selectiviteit, bindingskinetiek en structuurgebaseerd verbindingsontwerp wordt momenteel ook onderzocht.

Met de komst van structurele biologie is dit haalbaarder geworden. GPCRdb bevat nu hulpmiddelen om bindingsplaatsen en activatietoestanden van GPCR's te vergelijken, waaronder experimenteel bepaalde receptorstructuren, receptor-ligandencomplexen en receptor–G-eiwitcomplexen.

Een verbinding met goede structuren moet aan een functionele test worden onderworpen, zelfs als ze goede structuren hebben. Een molecuul kan binden aan een geschikt doelwit met een sterke bindingsaffiniteit zonder de beoogde cellulaire respons te activeren, of als alternatief kan een molecuul het gewenste pad activeren, maar niet op de juiste manier.

Conclusie

De G-eiwitgekoppelde receptoren zijn het beste te zien als niet alleen een membraanschakelaar, maar een flexibel signaalsysteem.

De receptor verandert van vorm als reactie op de binding van een ligand, de receptor vindt zijn partners in de cel en de omgeving van de cel bepaalt het verloop van het signaal. Daarom is het belangrijk om rekening te houden met de keuze van assays, de expressie van de receptoren, de timing van het pad, controles en orthogonale validatie.

De beste conclusies voor GPCR-onderzoek en geneesmiddelenontdekking worden vaak bereikt door een combinatie van structurele informatie en meer dan één functionele assay.

Veelgestelde vragen

V1. Wat is de belangrijkste functie van een GPCR?

Een GPCR is een celoppervlaktereceptor die reageert op een extracellulair signaal en een intracellulaire respons produceert. Het antwoord kan zijn via G-eiwitten, arrestines, tweede boodschappers, ionenkanalen of genregulatie.

V2. Worden alle GPCR's geactiveerd door hetzelfde G-eiwit?

Nee. Verschillende receptoren kunnen de voorkeur geven aan het activeren van verschillende G-eiwitten (Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13 of meerdere signaalpartners).

V3. Wat is een Orphan GPCR?

Een wees-GPCR is een receptor waarvoor de natuurlijke activerende ligand niet zeker is. Deze receptoren zijn nog steeds van groot belang voor fundamenteel onderzoek en geneesmiddelenontwikkeling.

V4. Dus, welke assay gebruik je voor GPCR-screening?

De "beste" assay hangt af van de vraag die wordt beantwoord en de signaalweg van de receptor. Verschillende aspecten van de respons kunnen worden gemeten met cAMP, calcium, GTPγS, arrestine en live-cell biosensor-assays.

V5. Wat is de reden voor onderzoekers om meer dan één assay toe te passen?

Eén assay kan slechts één pad meten of formaatspecifieke interferenties hebben. Als met een orthogonale assay kan worden aangetoond dat het waargenomen effect inderdaad receptorgerelateerd is, dan is het mogelijk te concluderen dat dit werkelijk een effect van de receptor is.