UV-transilluminator: Het juiste systeem kiezen en gebruiken voor gelvisualisatie

het resultaat is problematisch als een UV-transilluminator. Het leest DNA-, RNA- of eiwitbanden op een eenvoudige manier door ultraviolet licht door een gekleurde gel te laten passeren. De operator kan vervolgens de gel bekijken, er een foto van maken of de gewenste band uitknippen om er later mee te werken.

De meeste problemen hebben te maken met iets anders dan de aan/uit-schakelaar. Deze worden veroorzaakt door een verkeerde golflengte, incompatibele verlichting en vlek, te lange blootstelling en gebrek aan UV-bescherming.

Een goede UV-transilluminatorworkflow moet duidelijke banden bieden, met slechts minimale blootstelling aan het monster en de gebruiker van het instrument.

Hoe een UV-transilluminator werkt

De gel wordt vervolgens elektroforegeert, waarbij moleculaire fragmenten achterblijven die meestal niet met het blote oog zichtbaar zijn. Een fluorescerende kleurstof die zich hecht aan of met het te beitsen materiaal interageert. De gekleurde gel wordt vervolgens overgebracht op het verlichte oppervlak en de kleurstof wordt opgewekt door het ultraviolette licht en geeft een fluorescentie af die zichtbaar is voor het oog.

De donkere achtergrond en heldere banden stellen je in staat de grootte van fragmenten te benaderen, de intensiteit van monsters te vergelijken, versterkingsproducten te controleren of materiaal te vinden voor gelextractie.

Er zijn verschillende UV-transilluminators beschikbaar bij standaard golflengten van 254, 302 en 365 nm. Sommige bieden één golflengte, andere twee of drie; Wat het beste is, hangt af van het type instrument en de gewenste golflengte. Gelkijk- en elektroforesetoepassingen maken gebruik van een breed UV-bereik rond 302 nm.

Selecteer de golflengte voor de daadwerkelijke toepassing

De intensiteit van de fluorescentie, schade aan het monster en kleurcompatibiliteit worden beïnvloed door de keuze van de golflengte.

Een 302 nm-bron wordt vaak gebruikt bij het bekijken van fluorescentief-gekleurde DNA- en RNA-gels, omdat deze doorgaans een signaal met hoge intensiteit oplevert en veel bekende nucleïnezuurkleuringen met deze bron kunnen worden gebruikt. Een eenvoudige oplossing voor routinematige gelcontroles en documentatie.

Als de vermindering van door UV veroorzaakte DNA-schade belangrijker is dan het sterkst mogelijke signaal, kan men overwegen langgolvige UV te gebruiken, die rond 365 nm ligt. Thermo Fisher raadt aan blootstelling aan DNA te minimaliseren en stelt voor om een langere golflengte (ongeveer 360 nm) te gebruiken als er DNA uit de gel wordt teruggewonnen.

Het gebruik van kortgolf UV (ongeveer 254 nm) voor routinematig bekijken van DNA-gels moet niet als automatisch worden beschouwd, hoewel sommige laboratoriumtransilluminators beschikbaar zijn. Het is geschikt om te gebruiken afhankelijk van het fluorescerende materiaal en de toepassing in het laboratorium.

De grootste golflengte is dus niet de meest effectieve optie. Het is degene die bij de vlek past en het monster voldoende bewaart voor de volgende stap.

Gebruik een andere kleur gelbeits voor een lichtbron van een andere kleur

Een transilluminator en gelkleuring moeten als één optisch systeem worden beschouwd.

Er zijn verschillende soorten kleurstoffen met verschillende kenmerken van excitatie en emissie. Een vlek kan een hoge UV-reflectiviteit hebben, een lage blauwe lichtreflectiviteit, en omgekeerd. Het camerafilter moet ook de uitgezonden fluorescentie doorlaten en de doorgang van ongewenste excitatiestraling voorkomen.

Voorafgaand aan een nieuwe assay:

• De golflengten die de vlek prikkelen, zijn lequel. De golflengten die de vlek opwekken zijn 'luequels'.
• De beslissing om wel of niet een fotografisch filter te gebruiken, wordt bepaald door de individuele fotograaf.
• De eigenschappen van de kleurstof (DNA, RNA of eiwit)
• Of de gel gesneden moet worden of niet, hoe wordt dat dan gedocumenteerd?
• Als de lichtbron een nieuwe technologie is, is er dan een methode om deze vast te leggen met het huidige beeldvormingssysteem?

Zo kunnen SYBR Safe gekleurde gels worden afgebeeld met geschikte fluorescentieapparatuur met een UV- of blauwlichtfilter – een filter dat wordt gebruikt voor ethidiumbromidebeeldvorming is mogelijk niet geschikt.

Als een afbeelding te zwak is, betekent dat niet per se dat er te weinig DNA in de gel zit. De oorzaak kan een ongeschikte excitatiegolflengte, verkeerd camerafilter, verouderde UV-lampen of te veel kamerlicht zijn.

Als de schade aan het DNA wordt hersteld, beperk dan de blootstelling aan UV-straling

Nucleïnezuren zijn gevoelig voor schade door UV-licht. Dit is belangrijk als een onderzoeker een DNA-band uit de gel wil extraheren en het resterende DNA wil gebruiken in een latere toepassing zoals klonen, ligatie, sequencing of andere toepassingen.

Langdurige blootstelling kan leiden tot het beschadigen van het DNA en andere schade, wat de kwaliteit van het teruggevonden DNA kan beïnvloeden. Blootstelling aan UV gedurende langere periodes kan schade aan DNA veroorzaken, wat gevolgen kan hebben voor latere toepassingen zoals subklonering, merkt Thermo Fisher op.

In het geval dat UV-visualisatie vereist is:

1. Zet snijgereedschap en opvangbuis klaar voordat je het licht aandoet.
   1. Stel de laagste stand in, die een heldere band geeft.
   1. Blootstelling moet tot een minimum worden beperkt.
   1. Als het mogelijk is, denk dan aan een langere golflengte voor het UV-licht.
   1. Bekijk niet steeds dezelfde gel.
   1. Noteer de gekozen band en zet de bron uit.

Een blauwlichttransilluminator die compatibel is voor klonen, kan geschikter zijn voor bijzonder gevoelige kloonwerkzaamheden. Kleuren kunnen worden opgewekt door blauw licht, en er is minder schade aan het DNA toegebracht door blauw licht.

Controleer de uniformiteit van de verlichting

De transilluminator moet een uniforme verlichting bieden van het te bekijken gebied.

Als één kant van het oppervlak intenser is dan de andere, zullen identieke banden de verschillende intensiteiten zijn, afhankelijk van hun locatie op de gel. Dit is vooral relevant wanneer banen in hetzelfde laboratorium worden vergeleken en/of wanneer een afbeelding wordt gebruikt voor semi-kwantitatieve analyse.

De uniformiteit wordt beïnvloed door de staat van de lampen, de rangschikking van de lampen, filters, de netheid van de oppervlakken en het optische ontwerp van het instrument. Uniforme verlichting is belangrijk in de context van UVP om herhaalbaarheid van resultaten in verschillende banden en banen te bereiken.

Controleer altijd de achtergrond om te zien of die over de hele gel gelijk is, afhankelijk van de bandintensiteit. Het overbrengen van dezelfde gel naar een ander deel van het oppervlak kan helpen om een verlichtingsprobleem te ontstaan.

Gebruik het juiste kijkgebied

Het oppervlak waar het oppervlak verlicht is, moet voldoende zijn om de gel te bedekken zonder extra werkbankruimte in beslag te nemen.

Een beetje cel is ideaal voor standaard mini-gels. Grotere platforms zijn beter voor grote gels of meerdere gels naast elkaar. Er zijn commerciële systemen beschikbaar met verschillende verlichte gebieden, meestal van ongeveer 20 x 20 cm en groter.

Alle gel moet plat op het oppervlak liggen. Reflecties en vervaging van de banden zijn mogelijk door rimpels in de beschermfolie, te veel buffer of een oneffen bak.

Zorg dat het kijkoppervlak schoon is; Gebruik alleen materialen en schoonmaakmiddelen die compatibel zijn met het UV-filter. Afbeeldingen kunnen worden aangetast door krassen, vlekken of opgedroogde bufferafzettingen.

Zorg ervoor dat je de gebruiker beschermt tegen UV-blootstelling

Een UV-transilluminator is GEEN standaard kijklamp, maar een lichtbron met hoge intensiteit die is ontworpen voor gebruik in het laboratorium.

Zowel directe als indirecte blootstelling aan UV-straling kan leiden tot oog- en huidbeschadiging. De veiligheidsrichtlijnen van Stanford vermelden de volgende voorzorgsmaatregelen voor het gebruik van een transilluminator: houd de toegang tot de transilluminator onder controle tijdens gebruik, houd reflecterende oppervlakken weg van de transilluminator en plaats borden met de aangegeven dat huid en ogen beschermd moeten worden.

Gebruik altijd de beschermende bovenkant, het schild of de afgesloten beeldkastje die bij het instrument worden geleverd. Laboratoriumpraktijken die het gebruik van de gel vereisen, kunnen het bedekken van het gezicht, het dragen van handschoenen, een dichtgemaakte laboratoriumjas en het bedekken van de huid met UV-blokkers vereisen.

Ga er niet van uit dat gewone veiligheidsbrillen de UV-golflengte blokkeren. Draag geschikte beschermende uitrusting die voor het instrument is aangewezen en houd je aan de stralingsveiligheidsregels van het laboratorium.

Betere belichtingscontrole wordt bereikt met een gesloten gel-documentatiesysteem met veiligheidsvergrendeling, in tegenstelling tot werken over een open lichtkast. Sommige systemen staan niet toe dat de beelddeuropening wordt geopend terwijl deze in UV-modus werkt.

Docenten moeten een consistente kijkworkflow opzetten

Er is een eenvoudige track die gebruikt kan worden om onnodige variabiliteit te minimaliseren:

• Elektroforese en kleuring 1. Elektroforese en 1 kleuring.
• Zorg ervoor dat de vlek de juiste golflengte heeft.
• Zorg dat de buitenkant van de geltray schoon en droog is.
• Kies de golflengte en intensiteit van de benodigde UV.
• Leg de gel op het kijkgebied in het midden.
• Sluit het beschermingsscherm/beeldbehuizing.
• Gebruik de kortst mogelijke belichtingstijd om zichtbare banden te produceren.
• Maak de foto met het juiste emissiefilter.
• Zet het UV-licht uit bij het bewegen van de gel.
• Veeg het oppervlak na gebruik af.

Bij het uitvoeren van meerdere experimenten moet de kleurconcentratie gelijk zijn, evenals het beeldfilter, belichtingstijd, intensiteitsinstelling en cameracondities.

Sluit de transilluminator aan op de beeldworkflow

Als de gebruiker geen gel hoeft te inspecteren, kan een benchtop-transilluminator worden gebruikt. Voor veeleisendere toepassingen is een volledig gel-documentatiesysteem nodig, inclusief een camera, donkere behuizing, filters en beeldanalysesoftware.

Geïntegreerde systemen kunnen worden gebruikt voor beeldopname, bandmeting, documentatie en reguliere gelanalyse. Bio-Rad karakteriseert gel-documentatieplatforms, die beschikken over gecontroleerde verlichting en automatische beeldacquisitie- en analysesoftware.

De beslissing hangt af van wat het lab met de afbeelding gaat doen. In een onderzoekslaboratorium kan het onderwijslaboratorium een duidelijke visuele bevestiging nodig hebben, een onderzoekslaboratorium kan traceerbare beeldbestanden, consistente blootstelling en kwantitatieve bandanalyse nodig hebben.

Verwijder nooit de lichtbron

Zelfs als UV-lampen eruitzien alsof ze aan staan, verliezen ze na verloop van tijd hun output. Bij verminderde intensiteit zal de operator vervolgens de belichtingstijd verlengen, wat kan leiden tot minder consistentie en meer belichting van het monster.

Volg de onderhoudsrichtlijnen van de lampen van de fabrikant. Een UV-radiometer zou een objectievere maatstaf zijn dan visuele schatting en UVP heeft vastgesteld dat irradiantiemeting een geschikte methode is om de gebruiksduur van een UV-bron te monitoren.

Vervang lampen als set als aanbevolen test, maak het kijkfilter grondig schoon en noteer onderhoudsdata. Fluorescerende UV-lampen kunnen ook kwik bevatten en moeten volgens lokale voorschriften worden behandeld en afgevoerd als gevaarlijk afval.

Conclusie

Bij het gebruik van een UV-transilluminator voor gelvisualisatie kan hij dit snel en duidelijk doen, maar hij kan niet alleen fel zijn in ultraviolet licht om goede resultaten te behalen.

De golflengte moet geschikt zijn voor de kleuring en het gebruik stroomafwaarts. De verlichting moet zo uniform mogelijk zijn, de belichting moet zo kort mogelijk zijn, het camerafilter moet hetzelfde zijn als de uitgezonden fluorescentie, en de gebruiker moet beschermd zijn tegen UV-blootstelling van de lichtbron.

Het juiste instrument is het instrument dat rekening houdt met de grootte van de gel, een kleuringsmethode, de beeldvormingseisen, de workflow voor het terugwinnen van de monsters en veiligheidsmaatregelen voor de laboratoriumomgeving.

Veelgestelde vragen

V1. Waarvoor wordt een UV-transilluminator gebruikt?

Het wordt voornamelijk gebruikt om banden van gekleurd, fluorescentief, gelabeld DNA, RNA of eiwit in elektroforesegels te visualiseren. Het kan ook worden opgenomen in een gel-documentatiesysteem.

V2. Welke van de volgende golflengten wordt vaak gebruikt voor DNA-gels?

Een veelgebruikt gebruik van midrange UV (rond 302 nm) is voor het routinematig bekijken van de gels. De uiteindelijke selectie moet vergelijkbaar zijn met de beits, evenals de toepassing stroomafwaarts.

V3. Muteert UV-licht DNA?

Ja. Langdurige blootstelling kan DNA-schade veroorzaken en de klonbaarheid van het DNA en de latere toepassingen verminderen.

V4. Wat is effectiever: blauw licht of UV-licht?

Als UV-schade aan de gebruiker en/of DNA-schade een zorg is, wordt het gebruik van blauw licht aanbevolen voor compatibele vlekken. Zelfs bij sommige bekende vlekken kan UV betere excitatie geven.

V5. Waarom zit er een zwakte in de Gel Bands?

Dit komt waarschijnlijk door een lage monsterconcentratie, een ongeschikte kleuring, een ongeschikte golflengte of filter, verouderende lampen, te veel achtergrondlicht of slechte kleuring.