Moleculair Biologisch Beeldvormingssysteem: Het kiezen van het juiste platform voor gels en vlekken

Een moleculair biologisch beeldvormingssysteem levert een gedigitaliseerde output van een gel of membraan die kan worden bekeken, gekwantificeerd, opgeslagen en vergeleken. Het kan worden ingesteld om gels te scannen die DNA en RNA bevatten, gekleurde eiwitgels, chemiluminescente Western-blots, fluorescerende blots en colorimetrische monsters.

Er moet een systeem worden gebruikt om de assay te passen en niet andersom.

Hoe werkt een moleculair biologisch beeldvormingssysteem?

Een standaard beeldvormingssysteem zou een lichtdichte kamer, camera, lens, monsterstage, lichtbronnen die kunnen worden gebruikt voor de gewenste excitatie, filters die alleen licht met een bepaalde emissiefrequentie laten doorlaten, software voor de camera om het beeld op te nemen, en software voor het analyseren van het beeld.

In het geval van nucleïnezuurgels schijnt het instrument UV-, blauw- of andere geschikte lichten op een fluorescerende kleur. Wit licht wordt vaak gebruikt voor eiwitgels die zichtbaar zijn. Het licht dat wordt geproduceerd in chemiluminescente Westerse vlekken is hun eigen werk en komt voort uit een chemische reactie, dus er is behoefte aan een gevoelige camera en een donkere beeldkamer, maar niet aan een hoge lichtintensiteit op het monster.

Sommige all-in-one platforms bieden geldocumentatie, colorimetrische beeldvorming, chemiluminescentie en fluorescentie in één behuizing. Bio-Rad biedt bijvoorbeeld systemen om nucleïnezuur- en eiwitgels en chemiluminescente blots in beeld te brengen, en de systemen kunnen worden uitgebreid met een zichtbaar kanaal, ver-rood en nabij-infrarood fluorescentiekanalen.

Je kunt beginnen met de samples die je wel gebruikt

De eerste plek om te beginnen is op de labbank—niet op het specificatieblad!

Voor een onderwijslaboratorium met een primaire focus op agarosegels zijn UV-, blauwlicht- en witlichtbeeldvorming mogelijk de enige benodigde typen. Een nauwkeurig eiwitonderzoekslaboratorium vereist een delicate chemiluminescentie en een aantal fluorescerende kanalen.

Thermo Fisher verdeelt zijn visualisatiesystemen in systemen die eenvoudige visualisatie bieden en systemen die software-analyse en chemiluminescente Western blot en multikanaals fluorescerende beeldvorming bieden. Een handige herinnering: het geldocumentatiesysteem is niet per se een instrument als multimode moleculaire imager.

Stem de excitatiebron en het filter af op de kleuring

Elke fluorescerende kleurstof heeft een optimaal golflengtebereik voor zijn verlichting en voor de emissie van het licht. Het beeldvormingssysteem moet uitgerust zijn met een geschikte lichtbron om de kleurstof te exciteren, en met een emissiefilter dat de emissiefotonen (fluorescentie) de camera laat bereiken terwijl het licht dat gebruikt wordt om de kleurstof te exciteren wordt afgestoten.

Hieronder volgen voorbeelden van systemen die kunnen bevatten:

• UV-transilluminatie
• Blauwlichttransilluminatie
• Wit doorgelaten, licht
• Wit weerkaatsend licht
• Zichtbare fluorescerende excitatie
• Nabij-infrarood fluorescerende excitatie

Er is geen correlatie tussen het aantal lichtbronnen en de kwaliteit ervan. De sleutel is of de geïnstalleerde golflengten en filters compatibel zijn met de kleurstoffen, antilichamen en fluorescerende labels die al in het laboratorium worden gebruikt.

Controleer de reagentialijst van het laboratorium voordat je een systeem koopt om zeker te zijn dat het door de applicaties wordt ondersteund. Wees je ervan bewust dat niet alle fluorescerende kleurstoffen kunnen worden vastgelegd, omdat het systeem een "fluorescentiebeeldvormer" wordt genoemd.

Chemiluminescentie en fluorescentie lijken erg op elkaar

Bij chemiluminescente western blotting wordt het licht opgewekt door een chemiluminescente reactie die meestal gebaseerd is op een antilichaam-enzym en een luminescente substraat. Het signaal verandert in de loop van de tijd – beeldvorming moet worden gestart binnen het aanbevolen werktijdsbereik voor het reagens.

Western-blotting uitgevoerd door fluorescent vereist het externe licht van de excitatie. Het kan worden gebruikt voor multiplex-experimenten, waardoor meerdere doelen op hetzelfde membraan kunnen worden gedetecteerd via verschillende fluorescentiekanalen.

Chemiluminescentie wordt over het algemeen gebruikt voor de gevoelige en routinematige detectie. Wanneer multiplexing of stabiele signaalvangst of kwantitatieve vergelijking cruciaal is, wordt vaak voor fluorescentie gekozen. Er is geen enkele beste methode, omdat deze afhangt van de eisen van de test, de hoeveelheid doelwit, de antilichamen, de gebruikte labels en de analysedoelen.

Als een laboratorium routinematig beide tests uitvoert, moet het ervoor zorgen dat het voorgestelde systeem het mogelijk maakt om de tests zowel zoals ze zijn uit te voeren en zonder complexe hardwarewijzigingen.

Houd bij het fotograferen rekening met dynamisch bereik en verzadiging

Sommige blot kunnen één zeer sterke band hebben, en een aantal zwakke banden. De sterke band kan verzadigd raken als de belichting lang genoeg is om de zwakke signalen te tonen.

Wanneer er zoveel licht is dat de pixels van de camera niet meer kunnen vastleggen. Vanaf dat punt blijft de schijnbare helderheid van de getoonde band behouden, maar het intensiteitsniveau kan niet meer worden gebruikt voor kwantitatieve vergelijking.

Dynamisch bereik is het bereik van zwakke tot sterke signalen dat een beeldvormingssysteem in één afbeelding kan vastleggen. Een groter dynamisch bereik maakt het gemakkelijker om de zwakke en intense banden op te nemen zonder informatie te verliezen.

Sommige beeldvormingsplatforms kunnen verzadigde pixels detecteren, een geschikte belichting suggereren of meerdere belichtingen gebruiken. Ze kunnen het aantal trial-and-error beeldvorming verminderen, maar zijn niet bedoeld als vervanging voor een goed experimenteel ontwerp. Zelfs als monsters overbelast zijn, moeten ze nog steeds tijdens de assayfase worden gecorrigeerd en moeten antistofsignalen die te sterk zijn, ook worden gecorrigeerd.

Het gebruik van de automatische belichting moet worden vermeden

Automatische belichting kan nuttig zijn als meerdere personen om de beurt op het instrument spelen, of als er factoren zijn die het signaalsterkte moeilijk kunnen inschatten.

Sommige systemen krijgen korte initiële belichtingen en suggereren vervolgens een algehele blootstelling op basis daarvan. Lichtbron, focus en applicatie-instellingen worden automatisch door anderen geselecteerd.

Dit kan het mogelijk maken dat routinematige beeldvorming sneller verloopt, maar controleer dit alstublieft bij de operator. Controleer of:

• Opmerking: Verzadiging wordt aangegeven voor belangrijke banden.
• Zwakke banden zijn te zien bovenop de achtergrond
• Het hele gezichtsveld wordt bedekt door het volledige monster.
• Voor de beste resultaten werd de juiste beeldvormingsmodus gebruikt.
• Het benodigde filter en de tray werden gebruikt
• De volgende zijn kwantitatieve analyses en vereisen de blootstellingsprocessen:

Automatische instellingen zijn een goed beginpunt, maar GEEN excuus om het beeld niet te inspecteren.

Zorg ervoor dat de resolutie, gevoeligheid en het gezichtsveld allemaal correct zijn

Resolutie is belangrijk voor het beeld dat door een camera wordt vastgelegd, maar het aantal megapixels is geen indicatie voor de beeldkwaliteit van een camera.

Het is ook belangrijk om een nuttig systeem te hebben dat voldoende gevoelig is, een lage achtergrond heeft, goede optiek, uniform is en een voldoende groot gezichtsveld heeft om de gels of membranen die in het laboratorium worden gebruikt te kunnen huisvesten.

Als de chemiluminescente signalen zwak zijn, is een zeer gevoelige camera nodig. Hoe groter de afstand tussen banden, hoe minder resolutie nodig is; Hoe kleiner de afstand tussen de banden is en hoe belangrijker resolutie is, en hoe kleiner het kenmerk in het te scheiden monster, hoe meer resolutie nodig is.

Plaats de grootste labgeltray, blot of multi-gel tray op de plek van de beeldvorming voordat je ze koopt. Als een grote gel in meerdere afbeeldingen wordt gesneden, is er verspilde moeite en wordt het moeilijker om vergelijkingen te maken.

Zorg ervoor dat beelden consequent worden gemaakt

Het wordt aanbevolen om beelden onder dezelfde omstandigheden te maken bij het vergelijken van beelden.

Schrijf de beeldvormingsmodus, het type lichtbron, het filter, belichtingstijd, bind, focus, samplepositie, analyse-instellingen, achtergrond en eventuele achtergrondcorrectie. Indien nodig, hergebruik protocollen die opgeslagen zijn.

Als je kleurt of ontkleurt, zorg er dan voor dat de omstandigheden hetzelfde zijn voor nucleïnezuur- en proteïnegels. Beheers de lading van controlemonsters, de concentratie van de antilichamen, de tijd van het substraat en de omgang met het membraan bij Western blots.

De imager kan alleen het sample opnemen waarin het wordt geplaatst. Het kan geen ongelijkmatige overdracht, te veel achtergrond, overbelaste banen of het gebrek aan antistofspecificiteit oplossen.

Test de analysesoftware

Veelvoorkomende taken zouden niet moeilijk moeten zijn met beeldanalysesoftware, en de software mag het produceren van het resultaat niet verhullen.

Enkele handige functies kunnen zijn:

• Rijstrook- en banddetectie
• Schatting van het moleculaire gewicht
• Achtergrondaftrekking
• Bandintensiteitsmeting
• Verzadigingswaarschuwingen
• Normalisatie
• Multiplex-kanaalweergave
• Afbeeldingsannotatie
• Data-export
• Wanneer de gebruiker of het experiment wordt opgenomen.

Ingebouwde analyse is een voordeel voor routinematig werk, en desktopsoftware is mogelijk geschikter voor gedetailleerde analyses en voor het voorbereiden van de eindcijfers. Zo bieden thermo fisher-beeldvormingssystemen aan boord acquisitie en analyse, en externe softwareworkflows.

Houd het originele afbeeldingsbestand zo lang mogelijk zo lang mogelijk. Het aanpassen van de weergegeven afbeelding mag niet de ruwe verwervingsgegevens vervangen.

Zorg ervoor dat je voorzorgsmaatregelen neemt en extra stappen onderneemt om ervoor te zorgen dat je monsters veilig zijn

Het is belangrijk om passende afscherming te bieden, omdat het directe of gereflecteerde ultraviolet licht dat door het UV-beeldvormingsapparaat wordt uitgezonden, schade aan ogen en huid kan veroorzaken. De belichting kan worden verminderd door de beeldkamer te sluiten, die minder is dan een open UV-lichtkast.

Als het DNA uit de gel wordt geëxtraheerd, kan het gebruik van blauwlicht-excitatie beter zijn voor geschikte nucleïnezuurkleuringen. Witlichtbeeldvorming elimineert het gebruik van UV om de zichtbare eiwitkleuringen te bekijken.

Het systeem moet ook zo worden ontworpen dat verontreiniging van monster tot monster wordt voorkomen. Was de monsterbakken, verwijder bufferlekken zo snel mogelijk en volg de richtlijnen van de fabrikant voor het reinigen van de filters, lenzen en beeldoppervlakken.

Zorg ervoor dat het systeem is opgezet als een optisch instrument

De moleculaire biologie-imager kan niet af en toe worden schoongemaakt.

Lichtbronnen slijten na verloop van tijd, filters kunnen krassen raken, monstertrays kunnen vlekken en stof kan de beeldkwaliteit beïnvloeden. Laboratoria moeten verlichting bijhouden, trays en filters controleren, back-ups maken van acquisitieprotocollen, software zorgvuldig updaten en documentatie van onderhoud bijhouden.

Als de beeldkwaliteit niet goed is, doorloop dan het hele proces en kijk of er een probleem is met de camera of de rest van de keten. Dit kan veroorzaakt worden door de vlek, het monster of het substraat, de belichtingsinstellingen, de lichtbron of het filter.

Conclusie

Het meest bruikbare platform is niet altijd het platform met de meeste functies. Het is degene die de juiste verlichting, gevoeligheid, dynamisch bereik, software, beeldgebied en workflow biedt die andere gebruikers kunnen reproduceren.

De goede beeldvorming begint bij de monstervoorbereiding. Het instrument registreert het experiment, maar als de voorbereiding van de assay zorgvuldig wordt uitgevoerd en de verwerving herhaaldelijk wordt uitgevoerd, is het beeld (record) betekenisvol.

Veelgestelde vragen

V1. Wat kan een moleculair biologisch beeldvormingssysteem vastleggen?

Het kan DNA- en RNA-gels, eiwitgels, chemiluminescente western blots, fluorescent western blots en colorimetrische membranen vastleggen, afhankelijk van de setting.

V2. Wat is het verschil tussen een Gel Documentation System en een Western Blot Imager?

Niet altijd. Het basisgelsysteem ondersteunt mogelijk alleen beeldvorming met UV-, blauw- en witlichtbeeldvorming, en Western blot-beeldvormers kunnen gevoelige chemiluminescentie of multikanaalfluorescentiedetectie vereisen.

V3. Waarom is dynamisch bereik belangrijk? Waarom is dynamisch bereik belangrijk?

Een groot dynamisch bereik van signalen maakt het mogelijk om de zwakke en sterke signalen te vangen zonder de sterkste signalen te verzadigen. Dit geldt vooral voor kwantitatieve analyse.

V4. Kan Automatic Exposure worden vertrouwd?

Het kan nuttig zijn om een startbelichtingsbereik te bepalen. De operator moet ook andere factoren observeren zoals verzadiging, achtergrond, zwakke signalen en beeldvormingsmodus.

V5. Wat is de beste beeldvormingsmodus?

De gebruikte methode is afhankelijk van het monster, de kleuring, het label en het analysedoel. De lichtbron, het filter en de camera-instellingen zijn afhankelijk van de assay.