Cryo-elektronentomografie (Cryo-ET): Is uw monster klaar voor in situ structurele biologie?

De meest veelbelovende toepassingen van cryo-elektrontomografie zijn niet alleen: "Hoe ziet dit eiwit eruit?" maar ook: "Hoe ziet deze structuur eruit op de plek waar het daadwerkelijk functioneert?"

Dat onderscheid is belangrijk. Het gezuiverde complex kan ook een perfect niveau van structurele details bieden, terwijl membranen, aangrenzende complexen, celstructuur of virale structuur die belangrijk zijn voor de biologische kwestie, worden geëlimineerd. Cryo-ET pakt deze uitdaging op een andere manier aan, door veel projecties van een vitrined sample te nemen om een 3D-volume te reconstrueren.

Op dit moment biedt Longlight Cryo-ET aan als een in situ structurele benadering van biologische assemblages, membraan-geassocieerde complexen en virale systemen als onderdeel van zijn Cryo-elektronenmicroscopiedienst.

De praktische vraag bij het verzamelen van gegevens is echter,

Is de biologische vraag echt een vraag die een tomogram vereist?

Neem de biologische vraag vóór de microscoop

Soms vergelijken wetenschappers Cryo-ET met enkeldeeltjesanalyse, waarbij ze suggereren dat de ene superieur moest zijn aan de andere.

Het is meestal geen vergelijking van appels tot appels.

Single-particle cryo-EM zou een directere weg kunnen zijn naar een hoogresolutie gemiddelde structuur als een gezuiverd, relatief homogeen macromoleculair complex de biologische vraag kan beantwoorden. Cryo-ET wordt echter zeer aantrekkelijk als de positie/oriëntatie, moleculaire buurt, membraanomgeving of cellulaire organisatie van het doelwit relevant is.

Longlight's gids voor Cryo-EM met bijna-atomaire resolutie biedt enige achtergrond over het enkeldeeltjespad; Cryo-ET stelt een andere vraag: wat kan worden gezien wanneer de biologische context wordt gehandhaafd?

Eerste fysieke limiet—Elektronentoegankelijkheid

Als een monster biologisch interessant is, betekent dat niet per se dat het een elektronentoegankelijk monster is.

Directe cryogene tomografie kan mogelijk zijn voor virussen of andere geïsoleerde organellen, kleine cellen en dunne perifere gebieden van cellen. Sommige in situ workflows omvatten het verdunnen van monsters, wat noodzakelijk is voor nuttige transmissiebeeldvorming van grotere eosinucleïsche cellen die te dik zijn om te fotograferen.

Een goed gevestigde methode om dunne lamellen van cellen te maken is cryo-gefocuste ionenbundel (FIB) frees. Cryo-FIB-gemalde eukaryote cellen zijn gebruikt voor in situ studies om interne structuren toegankelijk te maken voor tomografie en daaropvolgende structurele analyse.

Monsterplanning mag niet beginnen met de spanning van de microscoop! Moet 'vanwaar' en 'hoe' de elektronenbundel het doel bereiken bevatten.

Een Tilt-serie is GEEN stapel foto's, het is een Dosis Budget.

Cryo-ET krijgt de informatie over de derde dimensie niet van één enkele blootstelling.

Dit exemplaar wordt vele malen gekanteld en een reeks 2D-projecties worden vastgelegd. Dit komt door de stralingsgevoeligheid van bevroren biologische monsters en de projecties moeten een beperkt totaal elektronendosisbudget krijgen. De effectieve dikte waar de elektronen doorheen gaan, neemt ook toe bij grotere kantelhoeken, wat betekent dat er mogelijk minder signaal bruikbaar is.

In conventionele tomografie is een volledige ±90° verwerving ook niet mogelijk vanwege de mechanische geometrie en de dikte van het monster. De niet-gesamplede informatie creëert de bekende ontbrekende wig in de Fourierruimte.

Maar meer projecties betekenen niet per se beter. De wisselwerking tussen kantelbereik, dosisverdeling, uitlijning, stabiliteit van het monster en de zichtbaarheid van het doel moet worden meegenomen.

Bepaal of je een Tomogram nodig hebt, een herhaalde structuur.

Niet alle Cryo-ET-projecten hoeven te eindigen in een bijna atomair moleculair model!

Vaak geeft alleen de tomografie een antwoord op de vraag: Waar bevindt zich een structuur? Wat gebeurt er met een membraan als het vervormd is? Wat is de organisatie van de virale componenten? Welke complexen liggen naast elkaar?

Een ander doel wordt weergegeven wanneer er meerdere kopieën van hetzelfde macromoleculaire complex zijn. De herhaalde doelen kunnen als subtomogrammen worden geëxtraheerd, uitgelijnd, geclassificeerd en gemiddeld om het structurele signaal te versterken.

In dit artikel geeft Longlight al een gedetailleerde uitleg van deze route. De kernvraag voor een nieuw project is dus van tevoren vastgesteld: is dit een unieke 3D-architectuur of zijn er voldoende vergelijkbare kopieën voor gemiddelde?

De verborgen bottleneck kan doellokalisatie worden.

Het kiezen van het beste cellulaire gebied kan net zo belangrijk zijn als het verkrijgen van een technisch goede kantelserie.

Stel dat het doelwit slechts een klein deel is van een grote cel. Zelfs als je een mooi tomogram uit het verkeerde gebied hebt, is het nog steeds de verkeerde dataset.

Om verzameld te kunnen worden, moeten ze daarom rekening houden met de hoeveelheid van het doel, de benaderende lokalisatie van de cellen, de herkenbare morfologie, de beschikbare informatie over de labeling en of een andere lokalisatiestrategie nodig is.

Deze biologische kaart kan de logica van het acquisitieplan voor membraan-geassocieerde doelen, virale assemblageplaatsen, organellen of ruimtelijk beperkte complexen aanzienlijk verbeteren.

Pre-sessieplanning voor Data Path:

Wanneer een tilt-serie is aangeschaft, is een Cryo-ET-project niet voltooid.

De beelden moeten vervolgens worden uitgelijnd, gereconstrueerd tot tomogrammen en onderzocht, gezocht naar doelen en gesegmenteerd, en indien geschikt worden overgedragen aan deeltjesextractie, classificatie en subtomogrammiddelen.

Daarom moet het gewenste resultaat vooraf worden vastgesteld vóór de incasso.

In Longlight's huidige Cryo-EM-dienst richten we ons op het leveren van einddichtheidskaarten, maar ook op ruwe data en tussenliggende verwerkingsbestanden. Dit is nuttig wanneer een onderzoeker verwerkingsbeslissingen wil controleren, daaropvolgende analyses binnen het systeem wil uitvoeren of later naar de dataset wil terugkeren.

Match platform met fase van het project

De kwaliteit van het instrument mag niet worden gebruikt om een onbepaalde steekproefvraag op te lossen.

Een eerste screening kan aangeven of de voorbereiding van het monster, de verspreiding van deeltjes, de ijskwaliteit en/of de zichtbaarheid van het doel verbeterd moeten worden voordat de dure verzameltijd wordt geïnvesteerd.

Longlight kondigde vandaag een gestaged cryo-EM platform aan bestaande uit Talos L120C G2 voor screening, Glacios 2 met 200 kV voor routinematige cryo-EM/tomografie en Titan Krios G4 met 300 kV voor veeleisende high-end acquisitie. Het is ook gekoppeld aan upstream eiwitworkflows via zijn bredere Eiwittoepassing portefeuille die structurele analyse combineert met haar portefeuille.

De vuistregel van onderzoek is:

Het sample is klaar, ga naar het volgende instrument, niet omdat het beschikbaar is.

Dit is de Laatste Cryo-ET Project Check.

Met betrekking tot het toewijden van een monster aan Cryo-elektrontomografie zijn er vijf vragen om te overwegen:

Is er behoefte aan een native ruimtelijke context? Is het interessegebied van het molecuul toegankelijk voor het elektron? Is er een betrouwbaar zicht op het doelwit? Bah, één tomogram of herhaalde deeltjes? Weet je welke soorten dataproducten na de acquisitie nodig zullen zijn?

Zodra die antwoorden zijn bepaald, wordt het kiezen van apparatuur en de verwerkingsstrategie veel eenvoudiger.

De kracht van cryo-ET is dat het informatie bewaart die verloren gaat tijdens de zuivering. Dit zal echter alleen nuttig zijn als de preparat, de beeldvormingsstrategie en de biologische vraag samen als één project worden ontworpen.

Onderzoekers kunnen raadpleeg Longlight Bij een in situ constructief project heb ik hen beschreven welk type monster ze zullen gebruiken, de doellocatie, het type constructie dat ze willen bereiken en welke downstream-analyse ze zullen gebruiken.

FAQ

V1. Cryo-elektrontomografie (Cryo-ET)?

Cryo-ET houdt in dat verschillende beelden van een biologisch monster in de vitrines vanuit verschillende hoeken worden genomen en vervolgens worden gereconstrueerd tot een 3D-tomogram. Een groot voordeel is dat het de structurele informatie bewaart in een bijna-natuurlijke biologische omgeving.

V2. Wat zijn de juiste voorwaarden voor het gebruik van Cryo-ET in plaats van enkeldeeltjes-cryo-EM?

Beschouw cryo-ET wanneer de positie van de cel, membraanorganisatie, moleculaire buren of native architectuur een belangrijke factor is voor de onderzoeksvraag. Wanneer de gezuiverde deeltje/gemiddelde moleculaire structuur centraal staat, is SPA vaak directer.

V3. Moet cryo-FIB freesen worden gebruikt voor alle monsters voor Cryo-ET?

Nee. Het is mogelijk om natuurlijk uitgedunde exemplaren direct te fotograferen. In dikkere delen van de cel kan dunner worden nodig om een elektronentransparant deel van de cel te creëren om de tomografie te verkrijgen.

V4. Wat ontbreekt er in Cryo-ET?

Mist 3D-informatie uit het beperkte hoekbereik dat kan worden verkregen tijdens kantelseries. Kan anisotropie veroorzaken, reconstructie-artefacten, die in de analyse in aanmerking moeten worden genomen.

V5. Moet de subtomogram-gemiddelde worden uitgevoerd voor elk project dat in Cryo-ET wordt uitgevoerd?

Nee. Een enkel tomogram kan voldoende zijn om vragen te beantwoorden met betrekking tot morfologie of ruimtelijke organisatie. De waarde van subtomogram-gemiddelde ligt in de mogelijkheid van uitlijning en gemiddeling van meerdere vergelijkbare kopieën van een doelwit wanneer deze beschikbaar zijn.