Ultrasonic DNA Fragmentation System: What Makes DNA Shearing Reproducible?

DNA breken is geen groot probleem.

Het belangrijkste is om het op te splitsen in een nuttige en herhaalbare fragmentverdeling, van het ene monster naar het andere, van de ene dag op de andere.

Daarom zou het vermogen om genomisch DNA te scheren niet het enige criterium moeten zijn dat wordt gebruikt om een ultrasone DNA-fragmentatiesysteem te evalueren. In plaats daarvan is de vraag voor een NGS-laboratorium of een monster duidelijk kan worden gedefinieerd en vandaag, volgende week, of in handen van een ander laboratorium kan worden geplaatst en toch kan worden doorgevorderd naar bibliotheekvoorbereiding zonder het hele proces te hoeven heroverwegen.

In plaats van een op zichzelf staand sonicatieproces te zijn, maakt gecontroleerde akoestische fragmentatie deel uit van Longlight's DNA/RNA-afschuiving workflow, die is ontworpen voor NGS-monstervoorbereiding. Dit onderscheid kan nuttig zijn bij het ontwerpen van een techniek die moet worden aangepast aan dagelijks laboratoriumwerk.

Begin altijd met het Fragmentprofiel en NIET met de stroominstelling.

Het doel van het experiment is niet om het instrument te plaatsen.

Het doel is de populatie DNA die uit de buis wordt verwijderd.

De definitie van wat er downstream van de bibliotheekworkflow wordt verwacht, is de eerste plek om te beginnen en dan terug te werken naar een akoestisch protocol. Een setting die een gunstige distributie genereert voor één array DNA, moet niet worden gezien als een universeel protocol voor andere arrays.

Dit is vooral cruciaal bij methodeoverdracht. Het is makkelijk om een sonicatieprogramma van een eerder experiment te dupliceren en het werk als volbracht te beschouwen. Monsterconcentratie, monstervolume, staat van het DNA, type buis en verwerkingsgeschiedenis maken in de praktijk allemaal deel uit van de methode.

Het systeem moet daarom worden gevalideerd rond het daadwerkelijke monster, in plaats van rond een aantrekkelijk getal dat op het meterscherm wordt weergegeven.

DNA komt met een verleden naar de Sonicator.

Het "genomische DNA" dat in twee buizen aanwezig is, is niet per se gelijke inputs.

Men kan hoogmoleculair DNA toevoegen van een schone extractie. Een ander kan opslag, meervoudige behandeling of een opslagzuiveringsproces hebben ervaren vóór het begin van fragmentatie.

Dat is belangrijk omdat de afschuifstap een middenstap is in een grotere stap.

Laboratoria moeten eerst variabelen identificeren die beheersbaar zijn (monstervolume, concentratiebereik van DNA, type container, temperatuurconditie en hanteringsprotocol) voordat een ultrasoon DNA-fragmentatieprotocol wordt geoptimaliseerd. Zo niet, dan kan de fout zich enkele stappen stroomopwaarts manifesteren als een schijnbaar instrumentprobleem.

In bijna alle gevallen van gefocuste echografie wordt de energie op het doel toegepast.

De traditionele sonicatiemethode zorgt ervoor dat onderzoekers vooral kijken naar de hoeveelheid echo die wordt gemaakt. De andere vraag over gerichte ultrasonicatie is: Waar gaat die akoestische energie naartoe?

De BoFU-systemen van Longlight vereisen geen probe die in het biologische monster wordt ingebracht, maar vereisen aspecten van gefocuste akoestische energie binnen een akoestisch medium. Gebruikt contactloze verwerking en geïntegreerde temperatuurregeling, het is BoFU-100 gefocusseerde ultrasone apparaat wordt gezegd dat het is ontworpen voor DNA-, RNA- en chromatineafschuiving, en genoomfragmentatie, voor NGS.

Die niet-contactvolle, gesloten opstelling is handig voor de fragmentatie van DNA, omdat het monster geen direct contact met een sonicatiesonde vereist. Het minimaliseert ook de sample-contactvariabelen en reiniging die anders in het protocol zouden zijn opgenomen.

Het is niet per se "meer echo".

Het is een meer gecontroleerde toediening van echografie.

Temperatuur maakt deel uit van de fragmentatiemethode!

Warmte is een factor die makkelijk over het hoofd wordt gezien omdat het geen aparte variabele is in het laatste sequencingbestand.

Thermische omstandigheden tijdens sonicatie maken echter deel uit van de monsterverwerkingsomgeving. Als de temperatuurgeschiedenis voor de ene run anders is dan de andere, wordt het protocol anders gereproduceerd.

Daarom is het belangrijk om temperatuurbeheer eerder in het ontwerpproces te bekijken dan akoestiek, en niet als een stuk apparatuur.

De gefocuste ultrasonicatorontwerpen van Longlight omvatten lagetemperatuur, constante temperatuur monsterverwerking en geïntegreerde detectie om warmte te regelen die tijdens de behandeling van de ultrasonicators wordt opgewekt.

Voor methodeontwikkeling, dat wil zeggen het vastleggen van temperatuurgerelateerde omstandigheden, net zo serieus als het sonicatieprogramma zelf.

Wat betekent "reproduceerbaar" met doorvoer?

Wat soepel verloopt met één buis wordt omslachtig als er voor de lunch 20 of 40 monsters binnenkomen.

Dus op dat moment is het meer een doorvoerprobleem.

Monsters kunnen gedurende verschillende tijden worden bewaard vóór de verwerking. Instellingen konden meerdere keren door de operators worden ingevoerd. Er kunnen variaties zijn tussen soorten exemplaren. Zo'n workflow, waarbij veel handmatig repetitief werk betrokken is, kan dus variatie veroorzaken, zelfs als de akoestische technologie zelf stabiel is.

Longlight's BoFU-800 Focused Ultrasonicator Heeft de mogelijkheid om tussen 1 en 8 monsters te verwerken, met voorwaarden die geoptimaliseerd kunnen worden, en batchinstellingen die kunnen worden toegepast als meerdere monsters gelijktijdig worden verwerkt.

De BoFU-1600 gefocusseerde ultrasone apparaat is ontworpen om monsters in grotere batchgroottes met 16 monsterposities te verwerken en de mogelijkheid om individueel of in batch te verwerken.

De belangrijkste vraag bij inkopen is dus: "Welk systeem heeft de meeste posities?"

Dat wil zeggen: "hoeveel monsters worden eigenlijk samen verwerkt, en hoe vaak vereisen die monsters verschillende protocollen?"

Kijk naar meer dan de gemiddelde fragmentgrootte

Een succesvol DNA-monster maakt geen succesvolle DNA-fragmentatieworkflow.

Een validatierun moet niet de schoonste run zijn, maar bestaat uit replicaties en batches. Wetenschappers moeten overwegen of de fragmentverdeling nog steeds geschikt is, of er ongebruikelijke staarten zijn of dat de fragmentverdeling breder wordt, en of de downstream bibliotheekvoorbereiding consistent werkt.

Dit is ook het moment waarop het laboratorium moet beslissen hoe de kwaliteit van de fragmenten routinematig wordt gecontroleerd.

QC wordt alleen uitgevoerd tijdens de ontwikkeling van de methode en niet gebruikt voor routinematige verwerking; kleine wijzigingen kunnen zich ophopen voordat iemand ze kan detecteren.

Het doel is niet om het vermogen van de sonicator om DNA één keer te fragmenteren te demonstreren.

Het idee is om een proces te creëren dat herhaalbaar is.

Kies instrument rond de bank, niet rond de brochure.

Elk lab heeft zijn eigen beperkende factor.

Een kleine onderzoeksgroep die af en toe DNA-, RNA- of chromatinemonsters doet, kan een kleine geïntegreerde workflow waarderen. Een sequencing-lab dat meerdere monsters tegelijk uitvoert, is mogelijk meer geïnteresseerd in parallelle verwerking. Kan meer doorvoer en herhaalbare/traceerbare instellingen tussen operators binnen een kernfaciliteit vereisen.

Om deze reden is het niet mogelijk om het juiste systeem alleen op basis van akoestische technologie te kiezen.

Volgens Longlights eigen Veelgestelde vragen over gefocuste ultrasonicator, in plaats van alleen een specificatie te kiezen, moet men rekening houden met factoren als akoestische energiecontrole, fragmentgrootteconsistentie, doorvoersnelheid, buiscompatibiliteit, onderhoud, servicebudget en laboratoriumbudget.

Laatste validatiecontrole

Stel voordat je een ultrasoon DNA-fragmentatiesysteem in je normale NGS-voorbereidingsprotocol opneemt, enkele praktische vragen.

Is het mogelijk om het gewenste fragmentprofiel in het laboratorium in meer dan één monster te verkrijgen? Zijn er invoervoorwaarden gespecificeerd? Wordt de temperatuur beheerst? Is het formaat van de buis/sample geschikt voor het protocol? Is het mogelijk om een hogere doorvoer te bereiken zonder overbodige handmatige variatie?

Als de antwoorden op die vragen duidelijk zijn, dan gaat de sonicatiestap van het creëren van een gefragmenteerd genoom niet zozeer over een op zichzelf staande sonicatiestap, maar meer over wat het zou moeten zijn: een gecontroleerde overdracht naar bibliotheekvoorbereiding.

FAQ

V1. Wat is een ultrasoon DNA-fragmentatiesysteem?

Het snijdt DNA mechanisch in kleinere fragmenten, met gecontroleerde akoestische energie, voor gebruik in workflows waaronder NGS-bibliotheekvoorbereiding. Deze energie kan worden overgedragen door een gefocust systeem via een akoestisch medium zonder dat het monster met de sonde hoeft aan te raken.

V2. Kan NGS-DNA-fragmentatie worden uitgevoerd met gerichte ultrasone sone?

Ja. Volgens een lijst gepubliceerd door Longlight is genoomfragmentatie voor NGS een van de toepassingen voor Longlight's op BoFU gerichte ultrasoonsystemen. Er zijn nog enkele protocolvoorwaarden die geoptimaliseerd moeten worden voor het specifieke monster en de stroom.

V3. Betekent meer ultrasoon vermogen beter?

Nee. Het doel is niet noodzakelijk de maximale akoestische energie, maar de reproduceerbare fragmentverdeling die kan worden gebruikt voor verdere downstream verwerking. De instellingen moeten afhangen van de conditie van het sample en het protocol.

V4. Waarom is het belangrijk om de temperatuur te beheersen tijdens DNA-afschuiven?

De aard van het ultrasone proces is dat warmte wordt opgewekt, waardoor temperatuur een verwerkingsparameter wordt. De gecontroleerde thermische condities zijn belangrijk om runs vergelijkbaar te houden wanneer ze herhaald worden met dezelfde fragmentatiemethode.

V5. Welke van de verschillende doorvoersystemen moet ik kiezen?

Begin met het aantal monsters dat gewoonlijk tegelijk wordt verwerkt en of de monsters onder dezelfde of andere omstandigheden verwerkt moeten worden. BoFU-800 kan 1–8 monsterverwerking verwerken en BoFU-1600 heeft 16 sampleposities voor grotere workflows.