Programmeerbare Ultrasone Disruptor: Bouwen van een herhaalbare sonicatieworkflow

Wanneer het laboratorium meer controle vereist dan een handzame homogenisator mogelijk maakt, kan een programmeerbare ultrasone disruptor de oplossing zijn. Kan cellen verstoren, deeltjes verspreiden, suspenties homogeniseren, nucleïnezuren afschuiven of monstervoorbereiding voor verdere analyse.

Het instrument is gemakkelijk te gebruiken. De uitdaging is om omstandigheden te vinden die het monster correct verwerken zonder schade aan het materiaal dat het laboratorium wil terugwinnen, en zonder oververhitting van het monster.

Hier komt programmeerbare besturing goed van pas. De operator kan de amplitude en/of de verwerkingstijd, de pulscyclus, de limiettemperatuur of de totale energie instellen zonder een knop ingedrukt te houden en zonder het resultaat op geluid te beoordelen. Nadat een geoptimaliseerde methode is vastgesteld, kunnen de geoptimaliseerde voorwaarden worden herhaald voor volgende monsters.

Hoe ultrasone verstoring werkt

De ultrasone disruptor is een apparaat dat de elektrische energie omzet in mechanische trillingen. Die trilling wordt doorgegeven aan een probe die door de omzetter in het vloeistofmonster wordt geplaatst.

Wanneer de probe met hoge snelheid in de vloeistof beweegt, ontstaan drukveranderingen die de vorming van microscopische vloeistofbellen veroorzaken. Deze belletjes groeien en krimpen en worden cavitatie genoemd. De krachten die in het lokale gebied worden opgewekt, kunnen ervoor zorgen dat celmembranen worden verstoord, aggregaten worden afgebroken en zo een betere menging of verspreiding mogelijk maken.

Qua praktisch gebruik levert de sonde een enorme hoeveelheid mechanische energie op een klein gebied. Daarom kan sonicatie van sonde snel zijn, maar ook schadelijk zijn voor een gevoelig doel, of schuim veroorzaken in een experiment.

Waarom programmeerbare besturing belangrijk is

Twee monsters kunnen voor dezelfde duur worden behandeld, maar niet dezelfde behandeling krijgen.

De beweging van ultrasone energie door de vloeistof wordt beïnvloed door: monstervolume, viscositeit, temperatuur, probediameter, onderdompelingsdiepte en containervorm. Het programmeerbare instrument stelt de operator in staat de variabelen te bedienen die realistisch gestandaardiseerd kunnen worden.

De moderne ultrasone processors kunnen een instelbare amplitude, getimede werking, pulsmodus, energiedisplay, energie-setpoints en temperatuurmeting hebben.

Deze functies zijn niet alleen handig, maar ook nuttig. Ze maken een methode eenvoudiger te documenteren en leggen precies uit hoe een monster is verwerkt.

Het volgende: "voor één minuut gesoniceerd." is een ontoereikende methode. Het moet het type probe specificeren, de amplitude-instelling, de pulscyclus, de totale verwerkingstijd, het monstervolume, de temperatuurregeling en het type container.

Gebruik een startamplitude, geen maximale wattage

Waarschijnlijk is de grootste fout te denken dat meer watt = meer vermogen per monster.

De amplitude is een maat voor de puntbeweging van de sonde en is directer geassocieerd met de sonicatie-intensiteit. Het door het instrument gebruikte vermogen varieert afhankelijk van de weerstand die door het monster, de probe, de viscositeit en de bedrijfsomstandigheden wordt gegenereerd. Wanneer een methode moet worden gereproduceerd, is het belangrijk om de amplitude, temperatuur, viscositeit en monstervolume gelijk te houden, zegt Sonics.

Begin bij het ontwikkelen van methoden met een matige amplitude en gebruik niet meteen de hoogste amplitude. Voer een klein testmonster uit, bekijk het resultaat en verhoog alleen de intensiteit van het proces als dat nodig is.

Overmatige sonicatie kan leiden tot betere verstoring van cellen, maar ook hogere temperaturen, schuimvorming, slijtage van de sonde en schade aan gevoelige eiwitten of cellulaire structuren veroorzaken.

De juiste amplitude hangt dus af van de toepassing. Cellyse en/of verspreiding van nanodeeltjes, de voorbereiding van organellen en/of het afscheren van DNA mogen niet hetzelfde zijn.

Warmtebeheersing met Pulse Mode

Met continue sonicatie kan de temperatuur van het monster snel worden verhoogd. Dit is van belang bij het gebruik van eiwitten, enzymen, membraanstructuren of andere temperatuurgevoelige materialen.

Mechanische methoden van celverstoring kunnen lokale verwarming veroorzaken, wat kan leiden tot eiwitdenaturatie of aggregatie. Daarom is het behoud van de kwaliteit van het monster belangrijk als de eiwitkwaliteit behouden moet blijven, en hiervoor moet het monster gekoeld worden gehouden.

Pulsmodus is een cyclus tussen sonicatie en ontspanning. In een off-cyclus krijgt het monster de tijd om af te koelen en zich rond de probe te vestigen vóór de volgende burst. Intermitterende werking wordt ook genoemd in de apparatuurhandleidingen om de warmteopbouw te verminderen en daarmee de consistentie in de verwerking te vergroten.

Pulsmodus maakt temperatuurregeling niet overbodig. Hoewel de buizen klein zijn, kunnen ze snel opwarmen, vooral bij hoge amplitude. Het kan nog steeds nodig zijn om een ijsbad, een gekoelde houder, een temperatuurprobe of een geprogrammeerde temperatuurafsluiting te gebruiken.

Zorg ervoor dat de probe overeenkomt met het Sample Volume

Er is een aanzienlijke invloed van het type probe dat wordt gebruikt.

Een kleine microtip verzamelt kracht in een klein element dat op een klein punt van hoge intensiteit kan zijn. Hoe meer vermogen je hebt, hoe meer materiaal, hoe groter de probe. Zoals blijkt uit de instructies van de fabrikant, zijn de diameter van de probe en het daadwerkelijke verwerkingsvolume sterk gecorreleerd, maar het eindbereik van waarden hangt af van het proces.

Een sonde die te groot is voor een klein monster kan spetteren en/of oververhit raken. Een kleine tip in een groot vat kan de ongelijkmatige verwerking veroorzaken en een onnodig lange verwerkingstijd hebben.

De sonde moet diep genoeg zijn om efficiënt energie in de vloeistof over te brengen, maar niet zo diep dat hij te veel lucht in het vloeistofmonster zuigt. Tijdens de trilling mag het niet in contact komen met de bodem of de zijkant van de container.

De vorm van de containers is ook belangrijk. Als een smal vat wordt gebruikt om energie te focussen, kan het energie anders focussen dan een brede beker en het gebruik van een andere buis of vat in dezelfde studie kan het resultaat veranderen, zelfs als de instrumentinstellingen hetzelfde zijn.

Bouw de methode op rond het voorbeeld – CSTA 2014, Sectie 2, Graad 12, Strand B, Taak 3

Meestal wordt na enkele korte pogingen een geluidsmethode voor sonicatie gevonden.

Begin met het echte type monster, de steekproefgrootte, concentratie, buffer en container die bedoeld zijn voor routinematige analyses. Moet het monster koud houden; Kies een geschikte sonde. Gebruik medium amplitude en korte pulsen.

Bekijk de uitkomst van elke proef met een methode die het werkelijke doel simuleert. Dit kan microscopie, eiwitopbrengst, enzymactiviteit, viscositeit en/of klaring na centrifugatie zijn. Het kan het meten van de deeltjesgrootte en/of visuele stabiliteit voor deeltjesdispersie omvatten.

Beoordeel succes niet op basis van de troebelheid of helderheid van het monster. Het verlies van activiteit van het doeleiwit kan zijn opgetreden vóór het verschijnen van het monster.

Nadat de acceptabele omstandigheden zijn vastgesteld, documenteer je de condities zorgvuldig en herhaal je de test met een aantal onafhankelijke monsters. Er is geen betere manier om de betrouwbaarheid van een methode te testen dan dat het zich herhaalt.

Veelgebruikte materialen in het laboratorium

Dit type programmeerbare ultrasone disruptors wordt veel toegepast in de volgende vakgebieden:

• De verstoring van de celwand van bacteriën en zoogdieren. De afbraak van bacteriële en zoogdiercelwanden.
• Het voorbereidende snijden van weefsels moet gevolgd worden door weefselhomogenisatie. Weefsels moeten na het eerste snijden gehomogeniseerd worden.
• Dit omvat de procedures die nodig zijn om eiwit- en nucleïnezuurmonsters te bereiden. De monsterbereiding van eiwit- en nucleïnezuren.
• Chromatineafschuiving door DNA of chromatineafschuiving. Afschuiving van DNA of chromatine.
• Een verspreiding van deeltjes en nanodeeltjes.
• Emulgering
• Deagglomeratie
• Extractie en mengen
• Moeilijkheid bij het voorbereiden van schorsingen. Moeilijkheid bij het maken van moeilijke ophangingen.

Er zijn verschillende fysische methoden die kunnen worden gebruikt voor cellyse, zoals sonicatie. De meest geschikte aanpak varieert afhankelijk van het celtype, de monstergrootte, de downstream toepassing en de gevoeligheid van het te extraheren materiaal.

Als een laag-intensieve verwerkings- of andere verstooringstechniek beter geschikt is voor gevoelige organellen of gemakkelijk te vernietigen eiwitten, gebruik dan die techniek.

Er zijn veelvoorkomende bedrijfsproblemen die je moet vermijden

Het schuimen wordt meestal veroorzaakt doordat de sonde te dicht bij het oppervlak van de vloeistof ligt en/of het monster dat te intens wordt verwerkt. Een lichte daling van de sonde, een afname van de amplitude of een verandering in de pulscyclus kan nuttig zijn.

De redenen voor slechte verbreking zijn dat de amplitude te laag is, de verkeerde probe wordt gebruikt, er te veel monster wordt gebruikt, het monster niet op de juiste diepte is ondergedompeld, of dat de totale verwerkingstijd te kort is.

Soms worden meerdere variabelen aangepast waardoor de resultaten inconsistent worden. De methode kan variëren afhankelijk van de gebruikte buis, de begintemperatuur van het monster, viscositeit, diepte van penetratie van de sonde in het monster en het volume.

Wanneer er een mechanisch geluid wordt gehoord of vreemd is, mag het niet worden genegeerd. Het kan een teken zijn van een losse probe, beschadigde probetip of een verkeerde assemblage. Het instrument moet worden gestopt en gecontroleerd voordat verdere verwerking plaatsvindt.

Probe-tips worden ook geërodeerd door cavitatie-erosie. Als het oppervlak beschadigd raakt, zal de energieoverdracht plaatsvinden en kunnen metaaldeeltjes in het monster worden gebracht. Controleer de sonde regelmatig en vervang deze volgens de instructies van de fabrikant.

Werk Veilig

Gebruik een juiste standaard en klem om de converter vast te zetten, maak geen onstabiele constructie.

Ultrasoneprocessors maken echter een hoorbaar geluid en de richtlijnen van de fabrikant adviseren gehoorbescherming bij gebruik. Een geluidsbehuizing zorgt voor een vermindering van de blootstelling en bevat ook spatten of aerosolen.

Hanteer biologisch materiaal correct en bevat het materiaal en volg de veiligheidsprocedures van het laboratorium. Controle over de diepte van de sonde moet worden toegepast om aerosolvorming en schuimvorming te minimaliseren. Spoel tussen de monsters door en ontsmet de sonde in een geschikte spoelprocedure die effectief is voor zowel de sonde als het monster.

Conclusie

Het resultaat wordt beïnvloed door de amplitude, de pulscyclus, de grootte van de probe, het volume van het monster, de temperatuur, de diepte van het monster in de container en de vorm van de container. Het moeilijkste tempo is geen goed beginpunt.

Een betrouwbare workflow begint met korte, goed gecontroleerde proeven, daarna gaat het over naar een juiste downstream-test om het resultaat te beoordelen, waarna er voldoende informatie wordt verzameld zodat deze door een andere operator kan worden herhaald.

Veelgestelde vragen

V1. Waar wordt een programmeerbare ultrasone disruptor voor gebruikt?

Voor cellyse, homogenisatie, dispersie van deeltjes, afschuiving van DNA, emulsie, extractie en diverse toepassingen voor vloeistofverwerking.

V2. Betere Hogere Amplitude?

Nee. Een toename van amplitude zal de intensiteit van de sonicatie verhogen, maar kan leiden tot meer verwarming, schuimvorming, slijtage van de sonde en schade aan het monster.

V3. Waarom wordt Pulse Mode gebruikt?

Pulsmodus: Rustperiodes tussen de ultrasone bursts. Dit helpt de warmteophoping te verminderen en het materiaal weer rond de sonde te laten terugkeren.

V4. Wat is de optimale grootte van de sonde?

Het volume, de grootte van het monstervat en de benodigde verwerkingsintensiteit moeten allemaal door de sonde worden aangepast. Kleine tips zijn goed voor kleine volumes en grote probes zijn goed voor grote volumes.

V5. Hoe maak je de resultaten van de sonificatie reproduceerbaar?

Probe, amplitude, pulscyclus, volume, temperatuur, onderdompelingsdiepte, monstersamenstelling.