Fluorometerkits: Een praktische gids voor kwantificatie van gevoelige monsters

In moleculaire biologielaboratoria kunnen DNA, RNA of eiwitten worden gemeten met behulp van een fluorometerkit die fluorescentie gebruikt. Deze assays zijn gebaseerd op kleurstoffen die een hoger signaal hebben wanneer ze aan een specifiek doel worden gebonden, in plaats van de totale UV-absorptie te meten. Deze selectiviteit is voordelig als monsters verdund, klein van volume of besmet zijn met andere stoffen die de absorptiemetingen kunnen verstoren.

Een volledige workflow omvat doorgaans een assayreagens, verdunningsbuffer, standaarden, assaybuizen of assayplaten, en een fluorometer die geschikt is voor de procedure. Het bereik van de assay is cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten, evenals de consistentie van de voorbereiding van de standaarden, bescherming tegen onjuiste lichtblootstelling van de reagentia en het nauwkeurig vastleggen van alle verdunningen.

Een fluorometerkit bevat alle materialen en benodigdheden die nodig zijn om fluorescentie te meten

De meerderheid van fluorometer-assaykits bestaat uit een sterk geconcentreerde fluorescerende kleurstof, een assaybuffer en referentiestandaarden. Buizen, protocolkaarten of instrumentspecifieke assay-instellingen zijn ook inbegrepen in sommige kits.

De kleurstofchemie zal bepalen wat de assay zal meten. Selectieve dsDNA-kwantificatie moet worden uitgevoerd op een dubbelstrengs DNA-kit. RNA-, enkelstrengs DNA- en eiwitassays zijn gebaseerd op verschillende bindingschemie en zijn niet uitwisselbaar.

Een voorbeeld is dat commerciële kits voor dsDNA een geconcentreerd assayreagens, verdunningsbuffer en vooraf verdundde DNA-standaarden kunnen bevatten. Er zijn andere systemen beschikbaar die reagentia leveren die compatibel zijn met de enkele buis- of microplaatfluorometers met de juiste excitatie- en emissiegolflengten.

Soms is fluorescentie beter dan UV-absorptie

De schatting van de nucleïnezuurconcentratie door UV-spectrofotometrie is gebaseerd op absorptie bij 260 nm. Het is snel en nuttig voor zuiverheidsverhoudingen, maar zouten, vrije nucleotiden, eiwitten, RNA, DNA en andere organische verbindingen kunnen leiden tot een absorptiesignaal.

Fluorescerende assays worden ontworpen om specifieker te zijn voor een geselecteerde analyte. Dit kan helpen om de nauwkeurigheid van een lage concentratie of monster te verbeteren dat potentiële verontreinigende stoffen kan bevatten. Fluorometrische kwantificatie kan daardoor gevoeliger en selectiever zijn dan UV-absorptie voor het meten van specifiek DNA, RNA of eiwit.

Beide methoden kunnen in combinatie worden gebruikt. Fluorescentie kan worden gebruikt om de concentratie van een bepaald doel te meten en UV-absorptie kan een algemenere zuiverheidsmeting bieden.

Kies de kit voor de analyse en het meetbereik.

Er zijn verschillende soorten veelgebruikte fluorometerkits beschikbaar, zoals:

• Hooggevoelige dsDNA-assays
• Breed-scala dsDNA-assays
• RNA-assays
• ssDNA-assays
• Eiwitassays
• RNA-kwaliteitsassays

Laaggeconsentreerde extracten en voorbereide sequencingbibliotheken kunnen worden gedetecteerd met een hooggevoeligheidsassay. Assays met een smal bereik zijn beter voor monsters met hoge concentratie. Monsters buiten het gevalideerde bereik moeten worden verwaterd, anders kunnen de resultaten minder betrouwbaar zijn.

De kwantificatiebereiken tussen de hooggevoeligheid- en breedbereikkits kunnen verschillen en voor dezelfde analyte gelden. De assay moet daarom worden gekozen op basis van de verwachte concentratie, en niet alleen op basis van de naam van het monster.

De kit moet ook compatibel zijn met de fluorometer. Controleer de excitatie- en emissiekanalen, buis-/plaatformaat, monstervolume, kalibratiemethode en geprogrammeerde assay-opties. Specifieke protocollen kunnen vooraf worden geprogrammeerd in sommige fluorometers voor dsDNA-, RNA- en ssDNA-analyse, andere kunnen op maat worden geprogrammeerd.

Schrijf de definities voor Samplevolume en Throughput

Kleine volumes zijn nuttig als monsters moeilijk te verkrijgen zijn of bewaard moeten worden voor latere experimenten. Enkele microliter monster is vereist in sommige laboratoriumfluorometrische systemen, maar meestal wordt het monster in een groter volume werkoplossing geplaatst.

Doorvoer is ook een belangrijke factor. Voor incidentele metingen en kleine batches kan een fluorometer met één buis geschikt zijn. Een instrument of een microplaatworkflow die meerdere extractiemonsters of meerdere sequencingbibliotheken kan verwerken, kan de voorkeur hebben voor laboratoria met veel monsters.

Niet elk instrument is het meest praktisch. Een goed systeem moet herhaald pipetteren minimaliseren, de regelmatige voorbereiding vergemakkelijken en het werkelijke aantal monsters dat het laboratorium regelmatig zal verwerken matchen.

Om een consistente assay-workflow te volgen

Het volgende is een standaard fluorometer-kit protocol:

• A. De werkende oplossing is voorbereid. Er wordt een werkende oplossing gevonden.
• Het stellen van de noodzakelijke normen
• Elke onbekende steekproef wordt toegevoegd
• Samples en standards grondig samenvoegen
• Incubatie gedurende de opgegeven tijd
• Het voorkomen van reacties door onjuiste blootstelling aan licht
• Met een liniaal de breedte en lengte van de hersenen meten.9. Correcte meting van de hersenen met een liniaal.
• Toepassing van verdunningsfactoren van monsters

Gebruik gekalibreerde pipetten om standaarden en monsters op dezelfde manier te bereiden en te gebruiken. Als een pipettestap met een laag volume wordt uitgevoerd, kan een kleine volumefout een aanzienlijk verschil maken in de uiteindelijke concentratie.

De tijd die nodig is voor de incubatie is ook belangrijk. Het nemen van één monster aan het begin, en een ander aanzienlijk later, kan onnodige variaties veroorzaken. Sommige assays zijn ook gevoelig voor het temperatuurverschil tussen de standaarden en de monsters.

Gebruik standaarden, blanks en replicates op de juiste manier

Standaarden worden gebruikt om de hoeveelheid analyte te relateren aan de fluorescentieintensiteit. Ze moeten grondig gemengd zijn, correct gelabeld en uit de buurt van besmetting worden gehouden.

Wanneer een onbekend monster in een blank wordt geplaatst, is het gemeten signaal afkomstig van het reagens, de buffer, de buis of de achtergrondmonstermatrix. Replicatemetingen zijn nuttig als het monster waardevol is, de exacte concentratie dicht bij de assaygrens ligt of een onverwacht resultaat een kostbaar proces stroomafwaarts zou beïnvloeden.

Als er dubbele metingen zijn die niet overeenkomen, bereken dan niet simpelweg een gemiddelde van de twee metingen. Controleer de nauwkeurigheid van de pipetten, het mengen van het monster, de aanwezigheid van bellen, de schoonheid van de buis, de incubatietijd, de temperatuur en het gekozen meetbereik.

Mannen en vrouwen hebben verschillende manieren om pijn te meten

Enkele veelvoorkomende oorzaken van onbetrouwbare fluorometrische resultaten zijn:

• De keuze van de verkeerde assay voor het doel
• Een ongeschikt gevoeligheidsbereik selecteren
• Het niet gebruiken van de juiste container voor opslag en voorbereiding
• Inconsistente samplevolumes toevoegen
• De aanwezigheid van verontreinigingen in de standaarden of werkende oplossing.
• De val om bellen achter te laten in het optische pad.
• Het gebruik van bekraste of incompatibele buizen is verboden. Gekraste of incompatibele buizen zijn niet toegestaan.
• Overmatige blootstelling aan lichtgevoelige reagentia
• Denk er niet aan dat het aantal cellen in een monster wordt verminderd door verdunning.
• Gebruik van het apparaat buiten het bereik van het gevalideerde apparaat.

Geconcentreerde monsters kunnen ook pipetten of werkgebieden besmetten en toekomstige monsters met lage concentraties beïnvloeden. Dit wordt geminimaliseerd door verse tips, schone werkoppervlakken en een rationele steekproefreeks.

Verbind de meting met de downstream workflow door deze naar de downstream workflow te slepen

Fluorometerkits worden vaak gebruikt voorafgaand aan PCR, qPCR, klonen, sequencing-bibliotheekvoorbereiding, elektroforese, transfectie en andere workflows die gecontroleerde monsterinvoer vereisen.

Kwantificatie is belangrijk om monsters te normaliseren, extractieopbrengsten te vergelijken en consistente reactie-input te verkrijgen. RNA-assays (fluorescentie-gebaseerd) worden toegepast vóór andere toepassingen zoals RT-PCR en cDNA-bibliotheekvoorbereiding; DNA-kwantificatie wordt toegepast in diverse downstream toepassingen zoals PCR, klonen, transfectie en next-generation sequencing.

De keuze van de kit moet daarom worden afgestemd op de beslissing die na de meting wordt genomen. Tijdens een routinematige extractiecontrole kan een breed scala assay worden gebruikt, en een gevoeligere assay voor laag-input sequencing.

Bewaar en hanteer altijd reagentia op de juiste manier

Fluorescerende reagentia kunnen gevoelig zijn voor licht, temperatuur en handhaving. Bewaar, verwarmen, mengen en laten verlopen volgens de instructies van de kit. Niet alle fluorescerende kleurstoffen kunnen worden ingevroren, op kamertemperatuur worden bewaard of blootgesteld worden aan laboratoriumlicht.

Markeer duidelijk werkende oplossingen en onthoud de datum waarop ze zijn gemaakt. Controleer voordat je vermoedt dat originele monsters zijn veranderd, de leeftijd van het reagens, de opslaggeschiedenis, standaarden, pipetten, instrumentinstelling, temperatuur en buiscompatibiliteit.

Conclusie

Fluorometerkits zijn gevoelig en selectief in het detecteren van kwantificering van DNA, RNA of eiwit, vooral in waardevolle of verdunde monsters. Betrouwbare meting vereist dat de assay geschikt is voor het analyte- en concentratiebereik, het gebruik van een geschikte fluorometer, consistente voorbereiding van standaarden en controle van het gehele proces.

Het is niet de kit met de laagste aangegeven detectielimiet die de beste kit is. Het is die welke aansluit bij het type monster, de doorvoer, de downstream toepassing en de kwaliteitscontrole van het laboratorium.

Veelgestelde vragen

V1. Wat zijn de toepassingen van de fluorometerkit?

Er zijn verschillende kits beschikbaar voor dsDNA, ssDNA, RNA en enkele RNA-kwaliteitstesten. De chemie van de gebruikte screeningsmethode moet geschikt zijn voor het doelwit.

V2. Welke zijn effectiever, fluorometerkits of UV-methoden?

Ze zijn doorgaans specifieker en gevoeliger voor een bepaalde analyte. UV-absorptie kan nog steeds als geldig worden beschouwd voor de semi-final zuiverheidstest en voor het meten van de algehele zuiverheid van het monster.

V3. Hoeveel monster heb je nodig?

De volumes verschillen per test en instrument! Er zijn inderdaad veel benchtop-systemen beschikbaar, die slechts een paar microliter van het originele monster vereisen.

V4. Welk reagens wordt gebruikt voor een analyse van DNA-RNA?

Meestal niet selectief. Bij de routinetoepassing kan men de inhoud van DNA en/of RNA willen meten, en kan een assay specifiek zijn voor één op één of beide.

V5. Wat is de oorzaak van de variatie in de resultaten van verschillende replicaten?

Deze worden vaak veroorzaakt door een pipetfout, onvoldoende menging, bubbel, besmetting, temperatuur- of meetfouten.