Magnetische kraalafscheider voor DNA-extractie: een praktische selectiegids

De meeste focus bij DNA-extractie ligt op magnetische korrelchemie. De separator die de buizen bevat kan echter ook invloed hebben op het herstel, zuiverheid en de consistentie van de operator.

Vangtijd en consistentie van de vangzone zijn belangrijke prestatiefactoren voor een magnetische korrelscheider die nodig is om korrels die aan het DNA gebonden zijn efficiënt te immobiliseren zonder de voorspelbare immobilisatiepositie van de kralen tijdens aspiratie te compromitteren. In het geval van een zwakke, onregelmatige en/of slecht zichtbare vangzone kunnen kralen verloren gaan met het supernatant of kunnen ze worden opgehangen in een wasbuffer.

Hoe werkt magnetische kralen-DNA-extractie?

Magnetische kralenextractie omvat het gebruik van paramagnetische deeltjes die oppervlakken hebben die nucleïnezuren binden onder goed gedefinieerde chemische omstandigheden. Na de lyse bevorderen de juiste bindingsomstandigheden de adsorptie van nucleïnezuren op de gefunctionaliseerde magnetische kralen.

Het magnetisch veld oefent een kracht uit op de kralen en brengt ze naar de bodem van of naar de wand van het monstervat. Het supernatant kan vervolgens worden verwijderd door te pipetteren zonder centrifugatie. Voordat het DNA in de eluatiebuffer wordt geëlueerd, worden zouten, eiwitten en remmers eruit gespoeld door washbuffers.

De scheider is niet betrokken bij de chemische binding. Het doel hiervan is om de kralen betrouwbaar te immobiliseren tijdens de stappen van scheiding en vloeistofverwijdering. De MSG magnetisch rek van Longlight is een op permanente magneet gebaseerde buisscheidingsapparaat dat nucleïnezuren, eiwitten en cellen scheidt.

Waarom is magnetisch-Veld Belangrijk ontwerp?

De prestaties van een separator kunnen niet alleen worden bepaald door de sterkte van de magneet. De afstand tussen de magneet en het monster, de magnetische veldgradiënt, de buisgeometrie en de eigenschappen van de korrel beïnvloeden allemaal het vanggedrag.

Een goed veld zal kralen concentreren om een klein, gemakkelijk zichtbaar gebied te vormen. Dit vergemakkelijkt het verwijderen van het supernatant zonder de pellet te verstoren tijdens het plaatsen van de pipetpunten.

Een te agressief of ongelijk vangpatroon kan resulteren in compacte kraalklonten die niet gemakkelijk opnieuw te suspenderen zijn. Een slechte opstelling kan ervoor zorgen dat kralen te lang blijven hangen. Het ideale doel is om snel, grondig en herhaalbaar te scheiden zonder het proces van het volgende mengen te bemoeilijken.

Wat zijn Sommige Plaatsen waar DNA verloren kan gaan?

Het meest voorkomende verlies van kralen is wanneer het supernatant wordt verwijderd en gewassen. Als de pellet niet zichtbaar is, kan de pipettip deze verplaatsen en/of opzuigen.

Het probleem met de resterende vloeistof is anders. Onvolledige verwijdering van de wasbuffer kan leiden tot het overnemen van ethanol, zouten of andere componenten, wat PCR, ligatie of reacties op bibliotheekvoorbereiding kan beïnvloeden.

Het is ook belangrijk om het product niet te lang te drogen. Het te veel drogen van de kralen na de laatste wasbeurt kan het moeilijk maken om ze opnieuw te suspenderen en de elueringsefficiëntie verminderen. De doorzichtige vangzone leidt de operator naar de juiste verwijdering en de volgende stap op het juiste moment.

Wat is de Beste Match voor Tube-formaat en volume?

De separator moet de daadwerkelijke vaten bevatten die in het protocol worden gebruikt. Deze zijn doorgaans in de vorm van PCR-buizen, 8-buisstrips, 96-wellplaten, 1,5 mL of 2,0 mL microcentrifugebuizen en grotere conische buizen.

De locatie van een buis binnen een rack kan te ver van de magneet liggen voor een ander formaat. Goede uitlijning is belangrijk, zelfs als de buis fysiek kan passen, omdat slechte uitlijning kan leiden tot meer scheidingstijd of een onhandige plaatsing van de pellets.

Het werkvolume is ook belangrijk. De MSG-serie van Longlight omvat diverse kleine volumeformaten, variërend van microlitermonsters tot 2 mL in diverse PCR-vaten en standaard microcentrifugebuizen.

Wat is de Klopt Hoeveel doorvoer je moet hebben?

Een onderzoekslaboratorium dat met een handvol monsters werkt, wil misschien een klein rack dat goed zichtbaar is en buizen heeft die gemakkelijk toegankelijk zijn. Het formaat moet passen bij het diagnostisch of sequencinglaboratorium, de grootte van de batch en het multikanaals pipettenprotocol.

Het niet alle posities gebruiken is niet per se een probleem, maar wanneer een protocol met acht buizen wordt gebruikt, kunnen er verschillen in timing optreden tussen monsters wanneer het op individuele behandeling wordt toegepast. Voorspelbare korrelvangst over alle posities is belangrijk voor een hogere doorvoersnelheid, waarbij consistente buisafstanden ook belangrijk zijn.

Het NGS-monstervoorbereidingsportfolio van Longlight omvat magnetische scheiding, DNA-kwantificatie, DNA-fragmentatie en elektroforese, wat een meer geïntegreerde workflow voor monstervoorbereiding biedt.

Wassen – Hoe Is het te doen?

Nadat de kralen zich hebben gevormd, plaats je de pipetpunt aan de andere kant van de kraal. Laat de vloeistof langzaam genoeg worden verwijderd zodat er geen kralen van de magneet worden getrokken.

Voeg de gespecificeerde wasbuffer toe volgens het gestandaardiseerde protocol. Afhankelijk van de workflow kan wassen worden uitgevoerd met de buis op het rek of moeten de kralen volledig worden opgehangen tussen de wasstappen.

De methode moet aangeven of de kralen bij elke stap volledig verspreid moeten zijn. Verontreinigingen kunnen in klonten worden opgesloten als de resuspension niet volledig is, en kunnen grotere variatie in het gebruik van monsters veroorzaken als het mengen te agressief is.

Hoe is DNA geëlueerd Van de kralen af?

Zodra de laatste wasbeurten en het drogen (gecontroleerd) zijn afgerond, haal je het vat van het magnetische rek. Voeg de aangegeven elutiebuffer toe en suspendeer de kralen grondig opnieuw.

Het herstel van DNA kan worden beïnvloed door temperatuur, elutievolume, meng- en incubatietijd. Wanneer de eluatie is voltooid, zet u de buis terug in het magnetische rek en wacht u tot de kralen volledig zijn teruggevangen en de supernatant schoon is voordat u de supernatant met het DNA overbrengt.

De elusiepositie van de pellet is van bijzonder belang bij eluatie van een laag volume. Een compacte pellet, die verder van de aspiratiezone ligt, resulteert in meer teruggewonnen eluaat, maar zonder overdracht van kralen.

Hoe kan Separator Worden prestaties gemeten?

Herhaal extracties met hetzelfde monster, de kralenchemie en de persoon die de extractie uitvoert. Let op de tijd die nodig is voor scheiding, zichtbaarheid van pellets, het gemak van het verwijderen van supernatant en het gemak van het opnieuw ophangen van de kralen.

Controleer de hoeveelheid en kwaliteit van het DNA, en test ook de applicatie waarvoor je het DNA wilt gebruiken. Zelfs als een monster acceptabele absorptieverhoudingen heeft, kan het monster nog steeds voldoende remmer bevatten om invloed te hebben op PCR of sequencing-bibliotheekvoorbereiding.

Voor multi-tube en plate is consistentie tussen de posities belangrijk. Test meer dan één testlocatie – vergelijk resultaten dicht bij het midden en aan de randen.

Wanneer is een grotere biomagnetische scheider nodig?

Buisrekken kunnen worden gebruikt voor dagelijkse microliter- tot millilitertoepassingen. Scheiding van honderden milliliters of enkele liters reagentia, bioprocessing of productie kan nodig zijn.

Het is niet alsof een grotere magneet op die schaal verschil maakt. Vatdiameter, menging, parelreisafstand, velduniformiteit en procesmonitoring zijn belangrijker.

Longlight's biomagnetische scheiders, model MSG-250/MSG-1000 zijn nuttig voor opschaling voor de scheiding van nucleïnezuren, eiwitzuivering en andere batchprocessen.

Checklist voor kopers.

Controleer het volgende: buizentypen die worden ondersteund, het werkvolumebereik, hoeveel posities en of het compatibel is met enkelkanaals of meerkanaals pipetten. Kijk naar de locatie van de kralen en of de pellet nog zichtbaar is vanuit de normale werkhoek van de operator.

Vraag "scheidingsgegevens" aan in een parel- en vatvorm die vergelijkbaar is met uw protocol. Houd bovendien rekening met schoonmaakbehoeften, chemische bestendigheid, rekstabiliteit en het gemak van het inbrengen en verwijderen van de buis zonder plotselinge bewegingen.

Een productfamilie die uit meerdere volumes bestaat, kan de opleiding van laboratoriumpersoneel en methodeoverdracht voor laboratoria die meerdere extractieformaten gebruiken, vergemakkelijken. Magnetische scheiding en andere zijn van Longlight Algemene laboratoriumworkflowoplossingen.

Conclusie

De nauwkeurigheid van het verwijderen van wasvloeistof en de hoeveelheid DNA-bindend materiaal die in de buis achterblijft, worden direct beïnvloed door de magnetische parelseparator voor DNA-extractie. Een zichtbare pellet en een correcte buispositie helpen om een hoger herstel en betere herhaalbaarheid te bereiken met de uniforme kraalvangst.

De separator moet worden meegenomen in combinatie met de kraalchemie, monstervolume en vloeistofbehandelingstechniek. Labgebruikers kunnen hun buisformaat, batchgrootte en/of werkvolume-eisen per e-mail naar de Longlight sturen Contactpagina voor productmatching.

FAQ

Q1. Bindt een magnetische scheider direct aan DNA of bindt het aan een ander molecuul dat aan DNA bindt?

Nee. De kralen zijn bedekt met een oppervlaktechemie die zich bindt aan DNA. De scheider kan deze kralen vasthouden en de vloeistof eromheen afzuigen.

Q2. Is er één magnetisch rek voor elk type buis?

Meestal niet. Het werkvolume en de buisgeometrie moeten worden gecontroleerd, omdat de fysieke pasvorm niet noodzakelijk betekent dat de juiste afstand tot de magneet wordt gehandhaafd.

Q3. Welke tijd moet er worden toegestaan voor magnetische scheiding?

Het is afhankelijk van de eigenschappen van de kralen, het monstervolume, de viscositeit, de buisvorm en het magneetontwerp. Voer het gevalideerde protocol uit en wacht tot de supernatant vrij is.

V4. Waarom zijn magnetische kralen aanwezig in het uiteindelijke eluaat?

Kan de pellet tijdens het aspireren hebben verstoord of een te korte clearingtijd. Steek de buis voorzichtig terug in de magneet en breng het supernatant opnieuw over.

Q5. Is het mogelijk om RNA te extraheren met magnetische scheiders?

Ja, met een geschikte RNA-bindingskorrelchemie en extractieprocedure. Toch moet RNase-controle worden uitgevoerd.