Chromatine Shearing: Hoe bouw je een reproduceerbare ChIP-workflow

Het afscheren van de chromatine is een van de gevoeligste stappen in een ChIP-protocol. Fragmenten die te groot zijn, kunnen leiden tot een afname van resolutie en slechte immunoprecipitatie. Te hoge afschuiving kan leiden tot epitoop, DNA-eiwitcomplex en herstelbare materiaalschade.

Geen enkel programma werkt voor alle monsters. De chromatinerespons op ultrasone energie verschilt per celtype, fixatie, startmateriaal en afhankelijk van de efficiëntie van de chromatinelyse en het volume van het monster. Het gehele voorbereidingsproces moet worden gecontroleerd om betrouwbare resultaten te verkrijgen, in plaats van alleen de sonicatietijd te veranderen.

Wat is Afscheren van chromatine?

Voor immunoprecipitatie breekt het afscheren van de chromatine de gekruiste chromatine op in kleinere DNA-eiwitfragmenten. Antilichamen kunnen vervolgens worden gebruikt om chromatine te verrijken die geassocieerd is met een specifieke transcriptiefactor, histon of histonmodificatie.

Na immunoprecipitatie worden kruisverbindingen omgekeerd, DNA gezuiverd en worden verrijkte gebieden geanalyseerd door qPCR of sequencing. Longlight's ChIP-seq oplossingen bieden ondersteuning bij de studie van eiwit-DNA-interacties en genoombrede regulerende sites.

Chromatineafschuiving verschilt van gezuiverde DNA-fragmentatie omdat nucleosomen, geassocieerde eiwitten en formaldehyde-kruisverbindingen de toegankelijkheid en mechanische eigenschappen van DNA veranderen.

Waarom is Fragment Grootte belangrijk?

Grote fragmenten verminderen de positionele resolutie omdat het DNA dat wordt teruggevonden veel langer kan zijn dan de eiwitbindingsplaats. Ze kunnen ook achtergrond creëren wanneer er gebieden omheen zijn die niet specifiek zijn maar toch fysiek verbonden.

Ga er niet van uit dat zeer korte stukken per se beter zijn. Een overmatige hoeveelheid verwerking kan leiden tot verlies van immunoprecipitatie, verlies van gevoelige epitopen of tot een ongeschikt bibliotheekprofiel.

De optimale fragmentgrootte varieert afhankelijk van het ChIP-protocol, het biologische doel, het gebruikte antilichaam en de downstream-analyse. Daarom moeten laboratoria een acceptabele verdeling vaststellen voor hun eigen test en niet alleen een universele gemiddelde grootte.

Wat dacht je van Afscheren met cross-linking?

Crosslinking zal de interactie tussen eiwit en DNA behouden, terwijl te intense crosslinking chromatine moeilijk te fragmenteren kan maken en antilichaam-epitopen kan verhullen. Zwakke of tijdelijke interacties kunnen verloren gaan door onvoldoende fixatie.

De fixatietijd varieert afhankelijk van het type monster, concentratie van de reagentia, celdichtheid en doeleiwit. Het afkoelen moet ook uniform zijn, omdat het gedrag van de monsters zal veranderen bij verdere kruisverbinding.

Als het monster ondanks het verhogen van de akoestische energie blijft weerstand bieden tegen afschuiven, lost dit het onderliggende probleem niet op. De condities van kruisverbonden en afkoelen moeten worden overwogen voordat een agressiever programma wordt aangenomen.

Waarom celinvoer en Is Lysis Belangrijk?

Een overschot aan cellen in een kleine hoeveelheid kan dikke, plakkerige chromatine creëren die onregelmatig afschuift. Te weinig uitgangsmateriaal kan het verlies van de hantering vergroten en het moeilijker maken om de chromatinekwaliteit te beoordelen.

Het aantal cellen tussen experimenten moet gelijk worden gemaakt. Weefselmonsters vereisen extra zorg omdat er een groot risico is op het verkrijgen van een heterogeen lysaat door extracellulair materiaal, structurele verschillen en onvolledige dissociatie.

Voor de sonicatie is de effectieve afgifte van kernen en chromatine cruciaal. Onvolledige lyse kan resulteren in de aanwezigheid van ongebroken kernen of klonten cellen die op een andere manier aan energie worden blootgesteld dan de rest van het monster.

Hoe gefocust Ultrasone Helpt het om controle te verbeteren?

Sonicators worden gebruikt waarbij de energie direct aan het monster wordt doorgegeven. Variabiliteit en verontreinigingspotentiaal kunnen het gevolg zijn van de positie van de probe, de onderdompelingsdiepte en de techniek van de operator.

Gefocuste ultrasonicatie wordt gebruikt om akoestische energie via een koppelingsmedium in een gesloten monstervat te leiden. Dit resulteert in een meer gecontroleerde niet-contactverwerkingsomgeving.

De BoFU-100 gefocuste ultrasonicator levert temperatuurgecontroleerde DNA-, RNA- en chromatineafschuiving. De BoFU-1600 systeem biedt de optie voor een multikanaals laboratoriumworkflow bij het verwerken van meerdere monsters.

Welke parameters moeten geoptimaliseerd worden?

Akoestische intensiteit, werktijd, behandelingstijd, aantal cycli, pauzetijd, monstervolume en monstertemperatuur zijn belangrijke variabelen.

Verander één belangrijke variabele tegelijk tijdens de initiële optimalisatie. Wanneer intensiteit, duur en/of celconcentratie gelijktijdig variëren, kan het moeilijk zijn te bepalen of het resultaat beter of slechter was door beide veranderingen.

Test een kleine matrix van omstandigheden rond een redelijk startpunt en vergelijk fragmentverdelingen en DNA-herstel

- NIET de sterkste behandeling die resulteert in het kortste DNA!

Na het selecteren van een programma wordt het programma opgeslagen met de celmeetinvoer, buffer, buis en monstervolume. Zonder deze bijbehorende voorwaarden kunnen de sonicatieparameters niet betrouwbaar worden gereproduceerd.

Waarom is het zo Belangrijk dat Samples koel gehouden moeten worden?

De ultrasone behandeling gaat gepaard met verhittingseffecten en chromatine kan gevoelig zijn voor hitte. Eiwitschade, verlies van antistofherkenning en verhoogde variabiliteit kunnen een factor van warmte zijn.

De koeling gedurende de hele run moet hetzelfde zijn (zelfs tijdens de rest tussen de runs). De snelheid van de beweging van buizen tussen een ijsemmer en het instrument mag de temperatuur van het monster niet beïnvloeden.

Afscheren Kwaliteit Check: Hoe?

Na het scheren neem een representatieve aliquot. Keer de kruisverbindingen om, maak het DNA schoon en beoordeel de volledige fragmentgrootteverdeling met agarosegelelektroforese of een geschikte geautomatiseerde fragmentanalyzer.

Evalueer onbehandelde cross-linked chromatine niet alsof het gezuiverd DNA is. De schijnbare grootte kan misleidend zijn door een migratieverandering veroorzaakt door eiwitten en cross-links.

Het grootste deel van het materiaal moet binnen de grenzen van het laboratorium "geaccepteerd" zijn, met weinig tot geen grote populatie materiaal met hoog molecuulgewicht. De hoeveelheid teruggevonden DNA moet ook worden gemeten, aangezien een goed profiel niet waardevol is als veel DNA verloren is gegaan.

Waarom is er Inconsistent Chromatine Shearing?

Deze worden veroorzaakt door variabele fixatie, onnauwkeurige celtellingen, onvolledige lysis, variabel monstervolume, variabele buizentypen en temperatuurdrift.

Schuimvorming of luchtbellen zijn een probleem dat de akoestische koppeling kan beïnvloeden. Daarom moeten monsterbuizen worden gevuld, afgesloten en op dezelfde manier geplaatst. Voor methodontwikkeling hebben buizen van een gevalideerd type/gevalideerd lot de voorkeur.

Als er variatie is tussen de resultaten van een batch, kan dit erop wijzen dat er effecten zijn op de beproevingspositie of dat de timing van de monstervoorbereiding inconsistent was. Een eenvoudig runlog kan nuttig zijn om te zien of er variatie is gerelateerd aan de biologische, procedures of instrumenten.

Hoe moet een nieuw sampletype worden geoptimaliseerd?

Begin met een kleine fixatie en een akoestische matrix met materiaal dat representatief is voor een echt experiment. Gebruik geen waardevol of niet-vervangbaar monster voor de eerste test.

Beoordeel fragmentverdeling, DNA-herstel en immunoprecipitatieprestaties. Na het scheren kan de geschiktheid van chromatine voor ChIP worden geëvalueerd met behulp van een positief gecontroleerd antilichaam en bekende doelloci.

Zodra geoptimaliseerd, stel je de kritieke parameters in een SOP in. Voor meer informatie over gerichte echografie voor chromatinevoorbereiding, zie de Lijst van Longlight ChIP-aanvraagpagina.

Conclusie

Het gaat niet alleen om de ultrasone kracht om betrouwbare chromatineafschuiving te maken. De verschillende componenten van fixatie, celinvoer, cellysis, monstergeometrie en akoestische en temperatuurcondities moeten allemaal compatibel zijn.

De optimale methode zorgt voor de juiste fragmentverdeling en handhaaft immunoprecipitatieprestaties en terugwinning van materiaal. Elk laboratorium is welkom om contact op te nemen met Longlight via de contactpagina om informatie te geven over het type en de batch van hun monster en de ChIP-workflow die ze willen gebruiken voor ondersteuning van apparatuur en toepassingen.

FAQ

Q1. Waarom is er behoefte aan chromatineafschuiving?

Het splitst crosslinked chromatine op in kleinere stukken voor IP. Het gebruik van fragmenten van gecontroleerde grootte zal de resolutie van ChIP-qPCR en ChIP-seq verhogen.

Q2. Wat zou er gebeuren als chromatine te weinig wordt afgeschoren?

Zeer grote stukken kunnen leiden tot verlies van resolutie en een toename van niet-specifieke achtergrond. Overweeg om fixatie, lysis en akoestische omstandigheden opnieuw te evalueren voordat je de behandeling automatisch verlengt.

Q3. Is het mogelijk om chromatine te overmatig te schoren?

Ja. Als er te veel behandeling wordt toegepast, zal het herstel verkorten of zullen eiwit-epitopen en DNA–eiwitcomplexen beschadigd raken. Het is niet altijd verstandig om kortere fragmenten te gebruiken.

Q4. Moet chromatine tijdens de sonicatie op ijs worden gehouden?

Ja. De verwerking bij lage temperatuur is stabiel, wat helpt om de schade aan monsters en eiwitten veroorzaakt door hitte te verminderen. De temperatuur moet constant zijn tussen monsters en batches.

Q5. Is er een enkele chromatine-zij.eenRingprogramma dat toepasbaar is op alle celtypen?

Meestal niet. Het verschil tussen celstructuur, chromatinedichtheid, fixatierespons en monsterconcentratie bestaat en nieuwe monstertypen moeten beperkt worden geoptimaliseerd.