Ultrasnelle elektroforesebuffer: Snellere DNA-gels zonder helderheid te verliezen

Hoewel agarosegel-elektroforese eenvoudig en betrouwbaar is, is de tijd voor conventionele elektroforese soms een beperkende factor in een druk moleculair biologielaboratorium. Als een laboratorium dagelijks meerdere PCR-reacties, restrictiedigesten of klonenmonsters uitvoert, kan een run van 30 minuten een belangrijke bottleneck worden wanneer dagelijks meerdere gels worden verwerkt.

Een ultrasnelle elektroforesebuffer is geformuleerd met een lagere ionensterkte, wat de geleidbaarheid en stroom bij een gegeven elektrische veldsterkte vermindert en daardoor de Joule-verwarming beperkt. Dit maakt hogere veldsterktes mogelijk onder gevalideerde omstandigheden te gebruiken, waardoor de scheidingstijd wordt verkort terwijl de bruikbare bandresolutie behouden blijft.

Ultrasnel Electrophoresis Buffer—Wat is er?

Een ultrasnelle elektroforesebuffer is een elektroforesebuffer met lage ionensterkte die is geoptimaliseerd voor snelle scheiding van DNA-fragmenten in agarosegels. Levert de ionen die nodig zijn voor elektrische geleidbaarheid en chemische omstandigheden tijdens migratie.

De ionische sterkte van deze buffer is lager dan die van de meeste traditionele buffers, waardoor er minder warmte wordt geproduceerd onder een bepaalde bedrijfscondities door de stroom. Dit kan het gebruik van een hogere spanningsgradiënt in het laboratorium mogelijk maken en de looptijd verkorten.

Longlight's 50X supersnelle buffer wordt geleverd als een geconcentreerde oplossing en verkort de scheidingstijd van de gebruikelijke 30 minuten tot ongeveer 5-10 minuten, afhankelijk van de aanbevolen omstandigheden.

De reden waarom Lager Kan ionische kracht de loopsnelheid verhogen?

DNA heeft een negatieve lading en migreert naar de positieve elektrode in een elektrisch veld. Hoe hoger het elektrische veld, hoe sneller het DNA zich voortplant, hoewel conventionele buffers aanzienlijke warmte kunnen produceren bij een hoog elektrisch veld.

Oververhitting kan ervoor zorgen dat de agarose smelt, wat leidt tot gebogen banen, gebogen banden of schade aan de elektroforeseapparatuur. Een buffer met lage ionische sterkte resulteert in minder stroom; er wordt minder warmte opgewekt, waardoor het haalbaarder wordt om op hogere spanning te werken.

Dit betekent niet dat de spanning onbeperkt verhoogd kan worden. De afmetingen van de gel, de bufferdiepte, het ontwerp van de kamer en de omgevingstemperatuur en de stroomcapaciteit blijven de run beïnvloeden.

Will Faster Electrophoresis resulteren in minder resolutie?

Wanneer de buffer, concentratie van agarose, spanning en de afstand van de run geschikt zijn voor het monster, kan een goede scheiding worden bereikt met een snelle run. De condities worden doorgaans niet gecontroleerd wanneer een methode wordt overgedragen, wat resulteert in een slechte resolutie.

Om fragmenten te laten scheiden, moeten ze voldoende migratieafstand hebben als ze ongeveer ongeveer groot zijn. Als de run te vroeg wordt gestopt, kunnen ze worden samengedrukt, zelfs als de tracking dye is verplaatst, nabij de wellen.

Het is belangrijk dat laboratoria het verschil herkennen tussen een analyse om aanwezigheid of afwezigheid vast te stellen en een hoge resolutie analytische gel. De eerste moet mogelijk een kortere geltijd hebben, en de tweede kan een langere geltijd of iets lagere spanning nodig hebben.

Hoe bereid je een 1X werkbuffer voor uit een 50X concentraat?

50 x concentraat moet verdund worden tot een 1 x werkoplossing. Om bijvoorbeeld 1 L 1 werkpuffer te maken, meng je 20 ml 50 x concentraat met 980 ml gedestilleerd of gedemineraliseerd water.

Schud goed voordat je de kamer vult of uitwerpt. Voor zowel de voorbereiding van agarosegel als het laten draaien van de tank gebruik je dezelfde 1X-bereiding om de consistentie in geleidbaarheid van het systeem te behouden.

Verdunn de buffer niet onder de aanbevolen werkconcentratie om de stroom verder te verminderen. Zwakke buffering en/of inconsistente bandpatronen kunnen het gevolg zijn van verkeerde concentratie, wat kan leiden tot abnormale migratie.

Wat is de Klopt Spanning ingesteld?

De spanning moet worden bepaald door de effectieve gellengte en niet alleen worden geselecteerd uit een bekende opstelling op een voeding. Longlight raadt het gebruik van ongeveer 25–30 V/cm gellengte aan met zijn snellopende buffer.

Maar de uiteindelijke instelling moet ook rekening houden met de elektroforesekamer en het type gel en de buffertemperatuur. De uiteindelijke spanning moet ook rekening houden met de gellengte, monsterbelasting, kamerontwerp en buffertemperatuur.

De voeding moet stabiel zijn in uitgang op de gewenste instelling. De EP-600 elektroforese voeding gemaakt door Longlight is ontworpen om een stabiele elektroforese-voeding voor het laboratorium te bieden.

Welke Gel Voorwaarden Niet veranderd?

Buffer kan het gebruik van een agaroseconcentratie die niet geschikt is niet overwinnen. De lagere concentratie agarose zal de hogere molecuulgewicht fragmenten ondersteunen, en hoe hoger de agaroseconcentratie, hoe beter de scheiding van kleinere DNA-fragmenten.

De dikte van de gel is ook belangrijk. Dikke gels kunnen langer nodig hebben om te kleuren en kunnen meer hitte hebben. Schone vorming van putten en het belasten van monsters zonder de randen te beschadigen.

Een compatibele horizontale kamer maakt het mogelijk de elektrische omstandigheden gelijk te maken. De HE-50 Horizontaal Gel Systeem is compatibel met meerdere gelsystemen en heeft een laag-buffer verbruik kamerontwerp.

Welke kleurings- en visualisatiemethoden kun je gebruiken voor DNA?

Afhankelijk van het product en protocol kan een nucleïnezuurkleuring worden toegevoegd tijdens de bereiding van de gel of na elektroforese. Bij het vergelijken van een snelle buffer met een bestaande kleurmethode moet de kleurmethode hetzelfde zijn.

Zeer korte runs kunnen de waarneming van de intensiteit van kleuring beïnvloeden, vooral als banden een korte afstand lopen. Het is belangrijk om de belichting aan te passen, zodat je als gevolg hiervan geen automatische belichting van een conventionele run kopieert.

LongLight's RedView Nucleïnezuurkleuring kan worden gebruikt om DNA en RNA te visualiseren in agarose- en polyacrylamidegels en werkt met gangbare beeldvormingsapparatuur.

Is dat zo? Mogelijk om DNA te halen na een snelle controle?

Ja, zolang de buffer en kleuring geen effect hebben op gelextractie en latere reacties. Volgens Longlight heeft 50X Super Fast Running Buffer geen invloed op DNA-gelextractie of ligatie.

Minimaliseer onnodige blootstelling aan UV-licht en verwijder zo klein mogelijk een gelschijfje voor het beste herstel. De band moet gescheiden worden gehouden zodat deze voldoende onderscheidend is zodat er geen aangrenzend product wordt toegevoegd.

Wanneer validatie van een methode bedoeld is voor klonen, sequencing of een ander gevoelig downstream proces, beoordeel dan de opbrengst, zuiverheid en prestaties van teruggewonnen DNA.

Wanneer moet je de running buffer wijzigen?

Sommige buffers kunnen worden hergebruikt, maar hergebruik moet worden gecontroleerd en niet uitsluitend op basis van het uiterlijk. Bij herhaalde runs kunnen temperatuur, ionenverdeling en bufferprestaties worden aangepast.

Als de migratie vertraagt, de banden niet de verwachte vorm hebben of de oplossing besmet raakt, vervang dan de buffer. Een andere reden waarom dit een goed moment is om de buffer te controleren is dat de kamertemperatuur hoog is en na opeenvolgende runs sneller.

Als het monster belangrijk is of een lage input heeft, wordt aanbevolen om een verse werkbuffer te gebruiken om onnodige variatie te voorkomen.

Wat zijn de juiste stappen voor het laboratorium om de Switch te valideren?

Gebruik een bekende DNA-ladder en monsters. Gebruik dezelfde gelconcentratie, monstervolume en kleuringsmethode op de bestaande buffer en de ultrasnelle buffer en laat ze parallel draaien.

Match de looptijd, bandvorm, scheiding van dicht bij elkaar gelegen fragmenten en migratieconsistentie en beeldkwaliteit. Wanneer gelextractie betrokken is bij de workflow, evalueer dan ook de opbrengst van de gelextractie en één downstream reactie.

Zodra geaccepteerd, documenteer dan de verdunning, de spanningsgradiënt, de grootte van de gel, de lengte van de run en hoe de gel is gekleurd en hoe vaak de buffer is gebruikt. Longlight's Algemene reagentia en verbruiksartikelen zijn ontworpen om reguliere genomica- en moleculaire biologische toepassingen mogelijk te maken.

Conclusie

Ultrasnelle elektroforesebuffer kan agarosegelanalyse omzetten in een snelle kwaliteitscontrole. Het voordeel is dat het een lagere ionische sterkte mogelijk maakt en toch een hogere bruikbare elektrische veldsterkte.

Toch blijven alle aspecten van 1X-voorbereiding, gel- en running buffer-matching, agaroseconcentratie en temperatuurregeling cruciaal om betrouwbare resultaten te garanderen. Een korte zij-aan-zij validatie stelt laboratoria in staat de looptijd te verkorten zonder concessies te doen aan interpreteerbare bandseparatie.

FAQ

Q1. Kan een ultrasnelle elektroforesebuffer worden gebruikt met een DNA-gel?

Ja. Ontworpen voor snelle scheiding van DNA in agarosegel. Gebruikers wordt geadviseerd de compatibiliteit van de gelkamer, kleuring en downstream workflow te controleren.

Q2. Is de 50X buffer klaar om te gebruiken?

Nee. Een 50X concentraat moet verdund worden tot 1X vóór gelvoorbereiding of elektroforese. Het direct gebruiken van het concentraat zou resulteren in een extreem hoge ionensterkte en geleidbaarheid, wat leidt tot overmatige stroom- en warmteproductie tijdens elektroforese.

Q3. Wordt dezelfde buffer gebruikt voor het gieten en voor het aanbrengen van de gel?

Ja, dezelfde batch van 1X werkbuffer wordt aanbevolen voor beide. Dit helpt de buffersterkte in het hele gelsysteem te behouden.

Q4. Wordt de gel warm als de spanning wordt verhoogd?

Als de spanning of kameromstandigheden niet voldoende bufferen, kan het wel doen. Voor meerdere runs en/of warme laboratoria moet de buffertemperatuur worden gecontroleerd.

Q5. Is het mogelijk om DNA terug te winnen uit een snelle elektroforetische scheiding voor ligatie?

Ja, als een geschikte kleuring en buffer worden gebruikt. De initiële validatie door het laboratorium moet ook herstel en ligatieprestaties omvatten.