Een optimalisatiegids voor DNA-fragmentatie in moeilijk te lyseren monsters

DNA-fragmentatie is een integrale stap in de monstervoorbereiding in diverse disciplines, waaronder genomica, moleculaire diagnostiek en proteomica. De aanwezigheid van sterke celwanden of stijve weefsels vormt echter een grote uitdaging om consistente, hoogwaardige DNA-fragmentatie te bereiken. Deze gids behandelt de moeilijkheden die samenhangen met hardnekkige organismen en weefsels die worden gesteriliseerd, biedt enkele op bewijs gebaseerde optimalisatie-aanbevelingen en bespreekt de voordelen van gerichte echografietechnologie.

[DNA-fragmentatie | AAT Bioquest]

Uitdagingen die samenhangen met hardnekkig te lyseren monsters

Het scala aan biologische monsters die in onderzoeks- en klinische laboratoria worden gevonden, beslaat het microbiële en plantenrijk. Sterke celwanden van organismen zoals mycobacteriën en sporenvormende stammen, evenals cellulose- en ligninerijke plantweefsels, zijn bestand tegen de meeste standaard methoden voor monstervoorbereiding.

Wat maakt dat sommige monsters terughoudend zijn om te lyseren?

• In vergelijking met dierlijke cellen hebben celmembranen van gram-positieve bacteriën, mycobacteriën, schimmels en planten meer energie nodig, zowel mechanisch als chemisch, om te worden verstoord.

Wat zijn de effecten van onvoldoende lysis?

• Slechte verstoring van monsters resulteert in lage DNA-opbrengsten, bevooroordeelde sequencingbibliotheken en downstream effecten van PCR zoals lage efficiëntie en slechte kwantificatie.

Voor dergelijke monstertypen zijn standaardmethoden zoals chemische vertering, vries-dooicycli en kraalslaan afhankelijk van de toepassing van meer gecontroleerde mechanische verstoring vanwege hun inconsistente resultaten.

Vooruitgang in het begrip van DNA-fragmentatie

Belangrijke wetenschappelijke ontdekkingen legden een fundament voor het begrijpen van fragmentatie. In een grote studie uit 2025 hebben Fu et al. een methode van ultrasone afschering uitgevonden, gemedieerd door zirkoniakorrels, die met slechts 20 seconden sonicatie fragmenten van ongeveer 15 kilobasenparen uit gezuiverd λDNA kon opleveren. Deze methode verlegde de grenzen van single-molecule sequencing (SMS) door een oplossing te bieden voor de bottleneck van inefficiënte productie van fragmenten van ≥10 kbp met traditionele technieken van ultrasone afschuiving voor de voorbereiding van SMS-bibliotheken.

[Een snelle en efficiënte zirkonia-kraal-gemedieerde ultrasone strategie voor

DNA-fragmentatie tot 10 kbp - RSC Advances]

In een ander belangrijk werk dat in 2025 werd gepubliceerd, beschreven Hahmann en collega's van het Max Planck Instituut voor Polymeeronderzoek en de RWTH Aachen Universiteit het gebruik van ultrasoon geluid om sequentie-gecontroleerde fragmentatie van DNA te bereiken. Dit werk beschreef de omleiding van eerder willekeurige fragmentatie naar specifieke en bewuste zwakke plekken van een gedeeltelijk gespleten DNA-streng met behulp van knibbelen. Gepubliceerd in het tijdschrift Chem, bood dit werk nieuwe ideeën en extra dimensies voor de ontwikkeling van protocollen om gecontroleerde fragmentatie van complexe en uitdagende monsters te bereiken.

Uitdagingen en overwegingen bij de fragmentatie van DNA

[Johannes Hahmann, Boris N. Schüpp, Aman Ishaqat, Arjuna Selvakumar,

Robert Göstl, Frauke Gräter en Andreas Herrmann.

"Sequentiespecifieke, mechanoforvrije mechanochemie van DNA." Chem (2025).]

Om fragmentatie van DNA in resistente monsters te bereiken, moeten een aantal parameters worden gecontroleerd en verfijnd. De resultaten kunnen worden verbeterd door het volgende aan te passen:

• Ultrageluidsintensiteit en amplitude: Hogere intensiteit zorgt voor meer cavitatie en betere verstoring. Een hogere intensiteit verhoogt ook het risico op thermische en mechanische schade aan de monsters.

• Verwerkingstijd: Sonicatie gedurende langere periodes kan leiden tot onaanvaardbare overfragmentatie.

• Monstervolume en concentratie: De ingangsenergie voor verdunde en geconcentreerde monsters verschilt. Dit verschil moet worden gemeten om het optimale monstervolume te bepalen.

• Buffersamenstelling: Het gebruik van detergenten en chelatoren veroorzaakt synergetische verzwakking van celwanden en wordt versterkt door mechanische verstoring, waardoor de opbrengst toeneemt.

• Temperatuurbeheersing: Het verlies van warmtestabiliteit kan ervoor zorgen dat gefragmenteerde monsters denatureren en structurele integriteit verliezen. Dit kan gebeuren als het systeem zich in isotherme omstandigheden bevindt.

• Het aantal kralen en hun grootte: Bij het fragmenteren van kralen zijn de grootte en het aantal kralen belangrijk.

Saputra et al. (2024) vergeleken verschillende DNA-extractiemethoden. Ze toonden aan dat sonicatie resulteerde in hoogwaardig DNA. Volgens hun gegevens had 61% van het sonicatie-DNA de absorptie tussen 1,8 en 2,0, waarbij de achtergrond met een lagere golflengte minder uitgesproken was. Daarentegen resulteerde DNA-extractie met spinkolommethoden in een hogere opbrengst van geëxtraheerd DNA. Dit toont aan dat bij sommige diagnostische methoden de zuiverheid van het monster belangrijker kan zijn dan de concentratie van het monster.

Gefocuste Ultrasone Technologie: Een Precisie-alternatief

Veelvoorkomende technieken van sonicatie-gebaseerde methoden hebben verschillende nadelen. Sonicators veroorzaken monsterverontreiniging en vereisen intensieve schoonmaak, en zijn uiteindelijk de oorzaak van ongecontroleerde verhitting van monsters. Sonicators in het waterbad verspreiden energie en leveren inconsistente resultaten op.

Gefocuste echoplatforms, zoals BoFU-800, gebruik een totaal ander ontwerp. Het elimineren van energieverlies en het leveren van zeer herhaalbare resultaten en betrouwbaarheid bij het verwerken van moeilijke monsters zijn slechts enkele van de extra voordelen van sonicatie.

• Niet-contactverwerking: Gefocuste energiesystemen sonicateren in een akoestisch medium naar het monster. Contact tussen monster en probe wordt uitgesloten en besmetting door monster is onwaarschijnlijk.

• Echte lage temperatuurcontrole: De warmte van ultrasone verwerking heeft geen invloed op de resultaten. Met onze verbeterde meting en temperatuurregeling kunnen we nauwkeurige en bewuste veranderingen in de temperaturen in de monsters aanbrengen.

• Aanpasbare doorvoersnelheid: Elk van de acht voorbeeldposities kan individuele, aangepaste gebruikersinstellingen hebben. De gebruiker kan ook één tot acht monsters verwerken. Het systeem maakt flexibele doorvoercapaciteiten mogelijk.

• Batchverwerkingsmodus: Wanneer het sample in elke positie hetzelfde is, kunnen aangepaste instellingen op alle sampleposities worden toegepast. Dit stelt de gebruiker in staat om meerdere voorbeeldposities met één commando te verwerken.

• Volledige traceerbaarheid: Informatie over de verwerking van elk monster is op elk moment toegankelijk, waardoor volledige traceerbaarheid van experimentele records mogelijk is.

Toepassing op specifieke voorbeeldtypen

Mycobacteriën

De celwand van Mycobacterium tuberculosis is rijk aan mycolinezuren en is extreem moeilijk te doordringen. Gefocuste echo veroorzaakt mechanische cavitatie en scheurt de celwand om de kernlysisstap in ongeveer 60 seconden te voltooien. De totale tijd om het proces van koloniekweek tot monsterextract te voltooien is minder dan vijf minuten.

Filamenteuze schimmels

De celwanden van filamenteuze schimmels bevatten chitine en glucanen. Hoewel ze moeilijk te doordringen kunnen zijn, kan gerichte ultrasone de voorbereidingstijd van het monster terugbrengen tot minder dan vijf minuten en vereist slechts 60 seconden sonicatie.

Plantmaterialen

De belangrijkste bestanddelen van plantelijke celwanden zijn lignine en cellulose. Voor gerichte echografie is de mogelijkheid tot gelijkmatige en consistente homogenisatie en fragmentatie belangrijk om te voorzien in de diverse behoeften die variëren van plant- en dierweefsel-DNA-extractie.

FFPE-voorbeelden

Voor FFPE-weefsels brengt formaldehydekruisbinding uitdagingen met zich mee in elke fase van het proces. Gefocuste ultrageluid stroomlijnt de monstervoorbereiding door deparaffinisatie, lysis en DNA-fragmentatie te combineren in één snelle en efficiënte stap, waardoor de monsteropbrengst wordt gemaximaliseerd.

Voorbeeld van het optimale protocol

Bij het werken met een nieuw monstertype dat moeilijk te analyseren is, is de meest effectieve strategie voor protocolontwikkeling als volgt:

• Gebruik fabrikantinstellingen als basis: Vaak zijn voorbeeldtype-specifieke protocollen vooraf gekalibreerd en kunnen ze worden vertrouwd.

• Definieer acceptabele fragmentgroottes: Voor NGS liggen de fragmenten van bibliotheekconstructie vaak tussen 300 en 500 bp, terwijl long-read sequencing ≥ 10 kbp is. Maak rekening met de juiste grootte.

• Duur van constant-power shear in tijdsverloopexperimenten: Optimaliseer de lengte van het tijdsvenster.

• Elektroforesevalidatie: In tijdsverloop wordt rekening gehouden met monstervoorbereiding en fragmentgrootte.

• Documenteer en communiceer alle vereiste parameters: om een monstervoorbereidingsstap exact te repliceren, moet deze volledig worden gedocumenteerd in de bijbehorende protocollen.

• Thermische controle: De temperatuur van het monster moet binnen het streeftemperatuurbereik blijven om het inbrengen van thermische artefacten te voorkomen.

Toekomstige richtingen

Na enkele van deze eerder genoemde studies uit 2025 zullen we de integratie van klinische diagnostiek en engineering met moleculaire biologie blijven zien, wat leidt tot de creatie van geavanceerde en krachtigere tools voor DNA-fragmentatie.

Lei et al. toonden aan hoe miniaturiseerde gefocuste ultrageluidsapparaten, met de mogelijkheid om de fragmentatie van monsters van commerciële apparaten te evenaren, problemen van kruisbesmetting en inconsistente verwerking met traditionele systemen kunnen oplossen. Dit is een stap richting meer geautomatiseerde en geïntegreerde nucleïnezuurextractie, en de monstervoorbereiding in het laboratorium zal meer gestandaardiseerd en gemakkelijk beschikbaar worden.

Voor onderzoeks- en diagnostische laboratoria die gerichte ultrageluidstechnologie integreren om de fragmentatie voor moeilijk te lyseren monsters te optimaliseren, zijn de voordelen van gerichte ultrageluidstechnologie, waaronder precisie, eenvoudige implementatie en reproduceerbaarheid, overtuigend. De combinatie van gevalideerde workflows voor een breed scala aan monstertypes, zoals mycobacteriën, filamenteuze schimmels, plantweefsels en FFPE-secties, op één apparaat, verbetert de laboratoriumefficiëntie en de kwaliteit van de gegenereerde data, en versterkt en versnelt de vertaling van wetenschappelijk onderzoek en klinische praktijk.

Veelgestelde vragen

V1. Wat is DNA-fragmentatie? Welke rol speelt het voor moeilijk te lyseren exemplaren?

A. DNA-fragmentatie is noodzakelijk voor de voorbereiding van NGS-bibliotheken. Fragmentatie zelf is DNA opbreken in kleinere stukjes. Next-generation sequencing maakt gebruik van DNA-analyses met verschillende moeilijk te lyseren exemplaren, zoals planten en bacteriën, die conventionele lyse weerstaan.

V2. Kan gerichte echo mycobacteriën binnendringen zonder chemische voorbehandeling?

A. Gefocuste echografie biedt voldoende energie en stress aan de mycobacterielaag van mycobacteriën, en kan daardoor de chemische behandeling verminderen of deze volledig elimineren.

V3. Hoe verschilt gerichte echo van kraalkloppen voor plantweefsel?

A. Gefocuste echo is contactloos en isotherm, en biedt een meer uniforme en schuifmechanische behandeling die een betere controle en vermindering van weefselafbraak mogelijk maakt in vergelijking met kraalslagen.

V4. Wat is de typische grootte van DNA-fragmenten bij het gebruik van gerichte ultrasone beelden?

A. Fragmentgroottes kunnen sterk variëren tot 10 kb, en echografie kan worden gebruikt om fragmenten van 300-500 basen te targeten, terwijl de typische grootte voor next-generation sequencing ongeveer 300-500 basen is.

V5. Werkt gefocuste echosone voor het fragmenteren van DNA uit FFPE?

A: Gefocuste echografie kan effectief FFPE-deparaffinisatie en cellulaire lysis bereiken terwijl het kruisverbonden DNA afschuift. Het op de ultrageluid gerichte procedure is snel en verhoogt de totale opbrengst van gefragmenteerd DNA.