Horizontale gelelektroforese voor plasmide-DNA: het scheiden van supercoiled, gehakte en lineaire vormen

DNA-elektroforese is een veelgebruikte methode in de moleculaire biologie. Een van de toepassingen waarvoor het hoogste scheidingsniveau vereist is, is de bepaling van de drie belangrijkste topologische vormen van plasmide-DNA, namelijk supercoiled, gehakt (open circulair) en lineaire vormen. We zullen laten zien hoe het nieuwe HE-50 Horizontal Gel System plasmideisolatie en kwaliteitscontrole biedt, wat zorgt voor betere scheiding en reproduceerbaarheid.

[Vijf overwegingen voor het nucleïnezuurgelelektroforeseproces | Thermo Fisher Scientific - VS]

Plasmidetopologie: Drie vormen

Plasmide-DNA is niet uniform en is een mengsel van drie topologische isoformen. In de context van isolatie zullen deze vormen verschillende migratieraten vertonen tijdens DNA-elektroforese.

•Supercoiled (SC) vorm: Supercoiled plasmiden worden beschouwd als de snelst migrerende soort in een agarosegel.

•Geknepen (open circulaire/OC) vorm: De cirkelvormige opstelling van plasmide-DNA met een enkele strengbreuk is nu ontspannen en daardoor gehakt. Door de grotere effectieve grootte migreert deze isoform langzamer dan supercoiled DNA.

•Lineaire vorm: Breuk van beide covalente strengen van het plasmide resulteert in lineair DNA. Deze vorm van plasmide-DNA heeft een staafvormige structuur en de migratie is langzamer dan supercoiled, maar sneller dan bij het geknipte DNA.

Bij het analyseren van de kwaliteit van het plasmide-DNA dat wordt gebruikt voor de productie van DNA-plasmidvaccins, eisen de hoogste regelgevende instanties dat de preparaat uit ten minste 80% van het plasmide in de supercoiled vorm bestaat.

Belang van plasmidetopologie in onderzoek en biofarmacie

In plasmide-DNA beïnvloedt de vorm van de isoformen een aantal factoren in gerelateerde processen met betrekking tot vaccins:

•Transfectie naar zoogdiercellen: De superopgerolde vorm van plasmide-DNA is het meest effectief bij transfecties van zoogdiercellen in vergelijking met ontspannen en lineaire vormen.

•mRNA-vaccinproductie: De behoefte aan linearized plasmidtemplates voor in vitro transcriptie (IVT) veroorzaakt open circulaire plasmide-verontreinigingen, wat de opbrengst en consistentie beïnvloedt.

•Gentherapie-vectorproductie: Hoogwaardige supercoiled plasmiden zijn essentieel voor de productie van adeno-geassocieerde vectoren (AAV).

•Stabiliteitsmonitoring: De opslagcondities en de duur van opslag beïnvloeden de plasmidestabiliteit naarmate de frequentie van gesneden of lineaire vormen toeneemt.

Recente onderzoeksontwikkelingen in plasmide-DNA-analyse

Twee van de recente studies benadrukken het belang van de hoogresolutie-scheiding van plasmide-DNA:

1. ZorE-gemedieerde plasmidide Knippen (2025)

Een studie, gepubliceerd in Nature Communications (maart 2025), richtte zich op de bacteriële verdedigingssystemen en toonde controle over de plasmidtopologieën aan. De onderzoeksgroep onder het Zorya Institute beschreef een langzame transformatie van supercoiled pSG483 plasmide-DNA naar zijn geknipte en lineaire vormen door het ZorE-eiwit. Dit werd opgemerkt als een geleidelijk proces, en de transformatie werd kwantitatief geanalyseerd met behulp van ImageJ om een densitometrische studie uit te voeren. Er werd opgemerkt dat de supercoiled plasmiden geleidelijk werden gegrepen door ZorE (768 nM) na 60 minuten incubatie bij 37 °C.

[ZorE-gemedieerde plasmide-afkniksing (2025)]

*"De reactie werd gestopt door EDTA en SDS toe te voegen, en de producten werden gescheiden met een gelelektroforese in een 1× TAE-buffer, 1,4% agarosegel, en werden na de beenis gekleurd met eb."* — Nature Communications, 2025

Deze ontdekking bleek cruciaal met betrekking tot DNA-fragmenten en eiwitinteractiestudies uitgevoerd met behulp van gelsystemen.

2. Non-B DNA en DNA-reparatie-eiwitten (2025)

Een PNAS-publicatie van het NIH in januari 2025 toonde aan dat het inbrengen van dinucleotideherhalingen in pUC18-plasmiden een cis-effect had op de binding van mismatch-reparatieeiwitten Mlh1-Pms1. EMSA's testten eiwitbinding bij concentraties variërend van 25 nM tot 400 nM in zowel supercoiled als linearized DNA. Non-B-vorm DNA verstoort de eiwitreparatiefuncties en draagt bij aan het begrip van DNA-instabiliteit.

[Non-B DNA en DNA-reparatie-eiwitten (2025)]

Belangrijke overwegingen bij de elektroforese van plasmide-DNA

Bij de elektroforese van plasmide-DNA is optimalisatie van elektroforetische resolutie cruciaal.

HE-50 Horizontaal Gelsysteem: Het Systeem van Keuze

De HE-50 Horizontaal Gelsysteem van Longlight Technology, gebruikt een uniform ontwerp dat gunstig is voor de elektroforese van plasmide-DNA.

1. Hoogwaardige scheiding

•99,95% Pure Platinum Elektroden: een cruciaal ontwerpelement voor het oplossen van supercoiled uit gesneden isoformen.

•Flexibel gelformaat: Onderzoekers kunnen gelafmetingen kiezen met een van de vier beschikbare tray-maten: 60×60 mm, 60×120 mm, 120×60 mm en 120×120 mm. De grootste grootte biedt een voldoende lange migratieafstand om dicht bij elkaar migrerende isoformen met hogere resolutie te visualiseren.

2. Gebruikersgericht ontwerp

•Geleide laadbak met zwarte achtergrond: De fluorescerende liniaal met een donkere achtergrond maakt het mogelijk om de pipetpunt zorgvuldig uit te lijnen met de putten wanneer meerdere monsters worden geladen voor een directe vergelijking.

•Hoogtransparante polycarbonaattank: Hoogzichtbaar ontwerp met ingebouwde tank toont migratie van de kleurstoffront en het elektroforeseproces zonder dat de tank geopend hoeft te worden en het systeem te onderbreken.

3. Veiligheid en efficiëntie

•Automatisch afsluitend deksel: Een veiligheidsschakelaar schakelt de stroom uit wanneer het deksel wordt geopend om het elektroshockgevaar te elimineren terwijl gebruikers monsters laden of de gelatine verwijderen.

•Lage bufferverbruik: De onderste migratiekamer bevat een brugontwerp dat minder buffer gebruikt en tegelijkertijd voldoende ionische omgeving biedt om consistente en betrouwbare DNA-elektroforese uit te voeren.

Stappen voor het analyseren van plasmidisoformen

Om de optimale scheiding van plasmide-DNA te verkrijgen met het HE-50-systeem:

• Maak de Agarose Gel: Kies een van de vier tray-maten om een 0,8-1,0% agarose gel te gieten. Analyseer plasmiden tussen 3 en 10 kb met 1× TAE-gegebuffreerde agarosegels.

• Monstervoorbereiding: Combineer plasmide-DNA-monsters met laadkleurstof. Gebruik 200 - 500 ng plasmide-DNA. De verhoudingen tussen kleurstofmonster en laadkleurstof kunnen 1:6, 1:3 of 1:1,5 zijn. Met een pipet laadt u de plasmidekleurstofmonsters in de agaroseputten.

• Elektroforese: Een gel met afmetingen 120 x 120 mm moet op 100 V worden gebruikt. Voor gels van 100 x 100 mm gebruik je 80V. Bromophenol blue mag 45-60 minuten inwerken. Elektroforese wordt gestopt wanneer de kleurstof 2/3 van de ondergrond bereikt.

• Visualiseren en documenteren: De belichte, transparante omslag maakt het mogelijk om een gel met UV te belichten en te fotograferen terwijl de omslag nog op zijn plaats zit. Wanneer er een moleculaire liniaal aanwezig is, wordt positieve fluorescentie waargenomen.

• Kwantificeer isoformverdeling: Geautomatiseerde geldocumentatiesystemen kwantificeren bandintensiteit. Het percentage supercoiled DNA wordt bepaald door het volgende: [SC-intensiteit] / (SC OC-lineaire intensiteiten) × 100.

Onbelemmerde workflowintegratie

Het HE-50-systeem is ontworpen voor ongehinderde integratie in bestaande laboratoriumworkflows:

•Integratie van de voeding: De vereiste 4 mm bananenstekkers zijn compatibel met de meeste elektroforesevoedingen (we raden constante spanning aan).

•Integratie van beeldvormingssystemen: Het UV-transparante deksel is compatibel met standaard geldocumentatie-beeldvormingssystemen, waardoor gels niet nodig zijn om van tanks naar imagers over te dragen.

•Protocoladoptie: Het systeem is compatibel met alle standaard agarosegelconcentraties en elektroforesebuffers (TAE, TBE, SB), waardoor eerder gepubliceerde plasmideanalyseprotocollen kunnen worden toegepast.

Conclusie

DNA-elektroforese is de meest eenvoudige en populaire methode om de kwaliteit van plasmide-DNA te evalueren. Onderzoekers kunnen hun kennis van de migratie van supercoiled, geknipte en lineaire isoformen gebruiken om de scheiding te optimaliseren en resultaten te interpreteren. Het HE-50 Horizontal Gel System biedt de mogelijkheden — pure platina elektroden, selecteerbare gelgroottes, laadgeleiders en controles — die essentieel zijn voor routinematige plasmidanalyse. Zoals vermeld in Nature Communications (2025) en NIH (2025), is agarosegelelektroforese een van de fundamentele methoden om de interacties tussen DNA en eiwitten te analyseren, evenals de topologie of structuur van DNA.

Het HE-50 Horizontal Gel System heeft het potentieel om volledig geïntegreerd en modulair te zijn in beeldvormingssystemen; op deze manier biedt het klanten meer opties voor betaalbare plasmide-DNA-beeldvormingssystemen. Voor meer informatie kunt u een offerteverzoek sturen naar Longlight Technology.

FAQ

V1. Kan horizontale gelelektroforese supercoiled en geknipt plasmide-DNA identificeren?

Het HE-50-systeem kan supercoiled, geknipte en lineaire DNA-plasmiden identificeren zolang er uniformiteit van het elektrische veld wordt bereikt en agarosegels van 0,8-1,2% worden gebruikt.

V2. Wat zijn de verschillende migratiesnelheden van de verschillende plasmidevormen tijdens elektroforese?

Omdat plasmidevormen structureel verschillend zijn, vertonen ze verschillende migratiesnelheden wanneer ze aan elektroforese worden blootgesteld. Lineaire plasmidevormen migreren bijvoorbeeld sneller dan cirkelvormen. DNA in lineaire vorm heeft een matige migratiesnelheid, terwijl DNA in de gesneden of open cirkelvorm de langzaamste migratiesnelheid heeft.

V3. Welk percentage van supercoiled DNA wordt als hoogwaardig beschouwd voor transfectie?

Een supercoiled vorm van het plasmide-DNA die meer dan 80% bedraagt, wordt over het algemeen beschouwd als een hoogwaardige plasmidpreparaat voor transfectie en gentherapie.

V4. Kan ik TAE-buffer gebruiken in plaats van TBE om plasmide-isoformen te scheiden?

Ja, in de meeste gevallen kan TAE-buffer worden gebruikt voor plasmideanalyse. De TBE-buffer is echter optimaal voor het scheiden van plasmide-isoformen wanneer de verschillen minimaal zijn en in uitgebreide afstanden.

V5. Waarom tonen mijn plasmidemonsters meerdere banden op de gel?

Meerdere banden worden meestal waargenomen voor supercoiled, geknipte en lineaire vormen van het plasmide. Andere banden kunnen het gevolg zijn van slechte vertering of afgebroken DNA- en RNA-besmetting.