Grote volume-scheidingen die gevoelige biomoleculen behouden

Grote volume-scheidingen zijn essentieel voor de productie van vaccins, gentherapieën en recombinante eiwitten. Toch degraderen de omstandigheden die schaal mogelijk maken — hoge debiatiesnelheden, schuifkrachten en druk — vaak gevoelige biomoleculen. Eiwitten denatureren. DNA-fragmenten. Virale vectoren verliezen aan potentie.

Intensivering van downstream verwerking met magnetische scheiding

Traditionele scheidingstechnieken werden ontwikkeld voor kleine moleculen. Biologische middelen zijn groter en veel gevoeliger dan kleine moleculen. Biologische middelen vereisen de scheidingstechnieken om de integriteit en gevoeligheid van het biomolecuul te behouden zodat het product bruikbaar is. Dit artikel toont een van de vele voordelen van het gebruik van een magnetisch scheidingsproces voor het biomolecuul, door de gevoeligheid van magnetische scheiding tijdens Large Volume Separation te tonen.

Traditionele Scheidingsmethoden

Wanneer de meeste ingenieurs de waarde van biomoleculen die verloren gaan na het scheidingsproces beschouwen, spreken ze over de efficiëntie van de biomolecuulbindingsfactor en de elusieterugwinning. De meeste afbraak van het product vindt echter plaats vóór het berekenen van de opbrengsten en tijdens de scheidingsfase.

Traditionele scheidingsmethoden stellen moleculen bloot aan talrijke schadelijke fysische en chemische vormen tijdens de scheidingsfase.

•Scheiding van membranen en kolommen: De stromen die de biomoleculen scheiden veroorzaken vouwen, rotatie en herschikking van de flexibele structurele en polymere moleculen, wat leidt tot aanzienlijke en soms onomkeerbare degradatie.

•Scheiding door verwarming of koeling: De meeste traditionele separatiemethoden vereisen cycli van verwarming en koeling van biomoleculen. Dit leidt tot de vernietiging van de biomoleculen en de vorming van aggregaten.

•Separatie, dat wil zeggen drukgestuurd: Mechanische en tangentiële stroming van biomoleculen die aan het oppervlak van het filter zijn gebonden, kan een breuk veroorzaken die schuif of onomkeerbaar is zodra het biomolecuul verloren gaat.

•Scheiding door het gebruik van elusiebuffers: Verandering in chemische omgeving en elusiebuffers met een lagere (of soms hogere) pH kunnen de conformatie van het biomolecuul veranderen.

Dr. Lydia Kisley en haar team van Case Western Reserve University toonden aan dat sommige commerciële separatiematerialen die als "volledig poreus" zijn gelabeld, centrale delen hebben die grotendeels inactief zijn. Dit betekent dat fabrikanten voor de volledige capaciteit betalen, maar slechts een klein deel van de potentiële prestaties ontvangen. Dit, gecombineerd met langere verwerkingstijden, kan leiden tot het afbreken van biomoleculen.

Intensivering van downstream verwerking met magnetische scheiding

Wanneer het cumulatief wordt genomen, leiden de verminderde specifieke activiteit, de toename van biomolecuulaggregatie en de lagere eindopbrengsten tot kostbare herverwerking.

Waarom conventionele verwerkingsmethoden Ceen't Verder ontwikkelen

Laboratoriummethoden hebben veel separatiemethoden die gebruikt kunnen worden, waarvan veel op industriële schaal onpraktisch kunnen worden.

Een voorbeeld van een methode met schaalproblemen is het gebruik van chromatografiekolommen.

•Vernauwd transport van het doelwit: In de verpakte bodemchromatografie vindt binding plaats door de diffusie van een analyte. Voor biomoleculen met een grootte groter dan 100 Da ligt de diffusietijd nabij het bindingsoppervlak en wordt een aanzienlijk gebied uitgesloten.

•Verstopping: Om blokkades in industriële kolommen te voorkomen, wordt de voedingsstroom vooraf gezuiverd.

•Verhoogd bufferverbruik: Kolommen op industriële schaal creëren een grote hoeveelheid gebruikte buffer, wat hogere kosten voor de operatie met zich meebrengt.

•Afschuifgevoeligheid tijdens het verpakken en bedienen: De mechanische krachten die nodig zijn om een uniforme bodemverpakking op schaal te behouden, kunnen de biomoleculen beschadigen waarvoor de kolom is ontworpen om te zuiveren.

Onderzoekers Julian Galbusera, Ines Zimmermann en Paula Fraga-García van de Technische Universiteit München hebben gedocumenteerd hoe magnetische scheidingstechnologie deze knelpunten aanpakt. In tegenstelling tot standaardchromatografie, waarbij de stationaire fase een matrix is van samengepakte kralen die worden doordrongen door een mobiele vloeistof, verwerkt magnetische scheiding de voedingsstroom direct door de gefunctionaliseerde magnetische deeltjes op te hangen. Hierdoor kunnen de diffusiebarrières die chromatografie doorgaans teisteren volledig worden omzeild, terwijl ze op grote schaal opereren en ongezuiverde lysaten verwerken.

Het magnetische alternatief: zacht, snel en schaalbaar

De principes van magnetische scheiding zijn fundamenteel verschillend. Gefunctionaliseerde magnetische deeltjes richten zich op specifieke moleculaire stoffen in suspensie. De toepassing van een extern magnetisch veld vangt de deeltjes-doelcomplexen op en maakt routinematige uitspoeling van ongewenste soorten mogelijk. Het deeltjes-doelsoort complex wordt tijdens de verwerking beschermd tegen afschuiving en thermische spanningen.

Voor massale scheidingsprocessen zijn de voordelen van deze techniek vanuit het perspectief van de scheiding van gevoelige biomoleculen verschillend:

•Diffusie door poriën is niet nodig: magnetische deeltjes zijn doorgaans niet-poreus. Zo wordt de langzame diffusiestap, die de bindingskinetiek van alle chromatografische methoden beperkt, omzeild. Het is vermeldenswaard dat grote biomoleculen direct aan de deeltjesoppervlakken binden.

•Zachte vangst en loslating: Het magnetisch veld oefent een zachte volumetrische kracht uit in tegenstelling tot de zeer hoge druk en zeer hoge pakkingsdichtheid die kenmerkend zijn voor gepakte-bed kolommen. Cellen blijven intact. Virale vectoren behouden de infectiviteit. Eiwitstructuren blijven gevouwen.

•Directe verwerking van ruwe ladingen: Magnetische scheiding kan troebele, met deeltjes beladen voedingsstromen verwerken zonder voorfiltratie. Dit elimineert één of meer eenheidsoperaties van de downstream-trein.

•Minimaal bufferverbruik: Omdat magnetische deeltjes worden opgehangen en teruggehaald in plaats van in een kolom worden gefixeerd, kunnen buffervolumes drastisch worden verminderd, wat zowel de kosten als de milieubelasting verlaagt.

Een studie uit 2023, gepubliceerd in Molecular Therapy—Methods & Clinical Development, toonde de praktische toepassing van dit principe aan. Onderzoekers ontwikkelden een filterloze magnetische vangmethode om recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV5) direct uit cellysaat te zuiveren. In minder dan twee uur behaalden ze een opbrengst van 63% uit ongeveer 5 liter lysaat, met een drielogaritmaarreductie in het DNA van gastcellen en eiwitten van de gastheercel, terwijl dieptefiltratie en kolomchromatografie volledig werden geëlimineerd.

Prestaties in de echte wereld eent Productieschaal

De vraag voor industriële fabrikanten is niet of magnetische scheiding in het laboratorium werkt—maar of het betrouwbaar presteert bij productievolumes. Het bewijs blijft zich opstapelen in de positieve.

•Liter-schaal eiwitzuivering: Onderzoek gepubliceerd in ACS Omega toonde aan dat een enkelstaps magnetisch visproces 91% zuiverheid van groen fluorescend eiwit (GFP) direct uit ruwe Escherichia coli-cellysaat op liter-schaal kon bereiken, met behulp van kale ijzeroxide-nanodeeltjes geproduceerd via eenvoudige coprecipitatiesynthese.

•Hooggradiënt magnetische scheiding op grotere schaal: Veel van dezelfde principes van hooggradiënt magnetische scheiding (HGMS) die laboratoriumzuivering mogelijk maken, worden gebruikt bij de productie van industriële mRNA-vaccins. Een groep maakte een 3D-geprinte, wegwerp HGMS-scheidingskamer van een materiaal dat voldoet aan USP Class VI. In dit geval werkte de kamer met een debiet van 150 mL per minuut, met een retentie van meer dan 99,39%. Dit betekent dat magnetische scheidingsmethoden de afvangefficiëntie behouden bij debieten die worden gebruikt bij grote volume-separaties.

•Toepassingen in celtherapie: Magnetische scheidingssystemen die worden gebruikt om T-celisolatie te automatiseren, bereiken een efficiëntie van meer dan 85% en een zuiverheid van meer dan 96%, op cGMP-klaar schaal voor onderzoek en productie, in 70 tot 100 minuten.

Longlight-technologie: Techniek fof thij Lange Run

Scheidingstechnologie die een groot, doorlopende service biedt, maakt Longlight Technology tot de technische focus.

Op het gebied van magnetische scheiding zijn de systemen van Longlight ontworpen om consequent een uniforme magnetische veldsterkte te behouden over grote vangvolumes - een van de meest kritieke vereisten om reproduceerbare resultaten batch na batch te leveren. Batch-tot-batch reproduceerbaarheid in grote volume-separaties is iets wat gereguleerde productieomgevingen simpelweg niet kunnen verdragen.

De verzameling systemen biedt antwoorden op de specifieke uitdagingen die grote volumeverwerking met zich meebrengt:

•Het vastleggen van magnetische krachten die sterk geconcentreerd zijn over de gehele vangstzone: Dit verwijst naar het probleem van ongelijke verdeling van een afnemende magnetische veldgradiënt, waarbij sommige deeltjes met hoge efficiëntie worden gevangen en andere blijven bestaan. Ze worden gevangen genomen en ontsnappen dan, wat de opbrengst afneemt en variabiliteit oplevert.

•Scheidingskamers (vaten) die efficiënt kunnen worden opgevangen naarmate het volume van de kamer toeneemt van iets boven de laboratoriumschaal naar productiebatches.

•Procesflexibiliteit: Het systeem hoeft geen significante aanpassingen te doen om verschillende soorten magnetische deeltjes, binders en bedieningsprocedures te accommoderen.

Voorbij compromis

De evenwichtsoefening van biomakers bij het kiezen van efficiëntie bij scheiding of behoud van het biomolecuul komt ten einde. Technologie die magneten gebruikt in de bedrijfsvoering is niet iets wat de industrie nog test. Het is een gevestigde industriële praktijk en wordt onderbouwd in diverse peer-reviewed artikelen. Deze producten zijn te vinden in de voorraden van talrijke onbetwiste producenten en leveranciers in de sector.

In toepassingen waarbij de waarde van het einddeeltje (genafsluiting, m RNA-sluiting, monoklonale antilichaamsluiting, cel- en celproducten, enz.) het onderscheidende kenmerk is, magnetische scheiding:

1. Behoud van biologische activiteit die verloren gaat bij conventionele scheiding;

2. Elimineert verschillende scheidingsoperaties door de initiële voeding te verduidelijken.

3. Vereist minder buffer en minder contact met de chemicaliën.

4.II is eenvoudig aan te passen van R&D naar de volledige productielijn.

De wetenschappelijke basis is goed gevestigd. De techniek is volwassen. De vraag is nu niet of magnetische scheiding thuishoort in bioprocessing met grote volumes, maar hoe snel fabrikanten het zullen adopteren om te beschermen wat het belangrijkst is—de moleculen die therapeutische waarde leveren.

Om te ontdekken hoe magnetische scheidingssystemen grote volume-scheidingen in jouw specifieke proces kunnen aanpakken, bezoek dan www.longlight.com voor technische specificaties en applicatieondersteuning.

FAQ

V: Kan een groot volume ongezuiverde cellysaten worden verwerkt door magnetische scheiding?

A: Ja. Magnetische scheiding kan worden uitgevoerd op toevoerstromen met een hoge troebelheid en vereist geen voorfiltratie voor de toevoerstroom, waardoor het aantal eenheidsbewerkingen wordt verminderd.

V: Is het waar dat de eiwitactiviteit minder degradatie ondervindt bij biomagnetische scheiding?

A: Ja. Biomagnetische scheidingsmethoden zijn niet onderhevig aan hoge druk/snelheid of het gebruik van zware buffersystemen om biomoleculen te scheiden en terug te winnen.

V: Kan magnetische scheiding worden opgeschaald van laboratorium naar commercieel/industrieel gebruik?

A: Ja. De fysica van magnetische vangst werkt op dezelfde manier in milliliter- en honderdlitersystemen van elk volume.

V: Welke biomoleculen kunnen gemakkelijk worden verwerkt met magnetische scheiding in grote volumes?

A: Virale vectoren, mRNA, rProteinen, exosomen en cellen, enzovoort. Deze materialen zijn gevoelig voor mechanische of thermische spanningen.